目的:本实验通过观察六味地黄丸对APP/PS1双转基因小鼠的行为学及胆碱能系统影响、TLR4/NF-κB信号转导途径的作用,以及通过体外细胞实验,观察六味地黄丸含药血清对Aβ诱导PC12细胞的TLR4/NF-κB信号转导途径的影响,进而探讨六味地黄丸对AD的治疗作用及机制,为六味地黄丸从肾论治AD和临床用药提供重要理论支持。材料与方法:3月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠40只,相匹配的3月龄雌性野生型(WT)小鼠8只,体重(30±5)g。将40只APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组,每组8只。按照人与小鼠体表面积等效剂量换算方法,得六味地黄丸低、中、高剂量(0.59,1.18,2.36 g·kg-1·d-1,按生药量计,下同)组。西药布洛芬组用药量0.04 g·kg-1·d-1,生理盐水混匀,按体积10 m L·kg-1每日2次ig,正常组和APP/PS1模型组分别给予等体积生理盐水每日2次ig,以上各组连续治疗3个月。Morris水迷宫测定各组小鼠找到平台所需的时间(即潜伏期),在平台所在象限的停留时间,并计算此停留时间所占游泳总时间的百分比,记录穿越平台的次数。Morris水迷宫测定后,4%水合氯醛麻醉,经腹主动脉取血,分离血清后按照乙酰胆碱(Ach)、乙酰胆碱转移酶(Ch AT)、乙酰胆碱酯酶(Ach E)、TNF-α、IL-1βELISA试剂盒说明进行操作。腹主动脉取血后,小鼠牺牲,取材,切片。免疫组化检测Aβ、GFAP及NF-κB,Real-Time PCR检测小鼠海马TLR4、My D88及NF-κB m RNA表达,Western blot检测小鼠海马TLR4、My D88及p-NF-κB蛋白表达。40只Wistar大鼠,自然采光,室温16-25℃。相对湿度60%的标准环境下,自由饮水进食,适应性喂养2-3d,随机分为两组,其中正常对照组20只,中药组20只。中药组给予生药质量浓度1.18g·kg-1·d-1的六味地黄丸粉末水溶液灌胃,10 m L·kg-1日两次,正常对照组给予等体积的生理盐水。根据前期预实验结果,持续灌胃3d后,血药浓度(以六味地黄丸被吸收后大鼠血清中马钱苷含量计算)达到稳定,同时考虑实验时间及效率,选取连续灌胃5d后取血。第5d首次给药2小时左右,10%水合氯醛麻醉溶液腹腔麻醉,经腹主动脉采血,制备血清。大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞,高分化,将细胞按5×105个/m L密度接种到25cm2培养瓶内,每瓶加4 m L培养基,分为正常对照组,模型组,10%六味地黄丸含药血清(根据前期预实验结果)治疗组,My D88沉默组,VE组。37℃,5%CO2的孵育箱中培养24 h,PBS冲洗2-3遍,换用无血清DMEM饥饿处理24小时,正常对照组,模型组,VE组换成含10%大鼠血清的DMEM培养基,VE组同时加入终浓度为20μg/m L的VE溶液,六味地黄丸含药血清组换用含终浓度10%的含药血清,各自预保护24小时后,除对照组外其他各组均加入终浓度为30μM Aβ25-35,37℃、5%CO2培养箱内作用36小时,进行后续操作。转染前24h,PC12细胞计数,按5×105/孔接种到标准的24孔板中。高糖DMEM培养基培养(不含抗生素),细胞生长丰度达60%进行转染。每孔加入Lipofectamine 2000 5μL+20μM si RNA 5μL。转染进行24小时后,将培养基更换为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基。48小时后在荧光显微镜下观察si RNA荧光显色,确定转染效率。当细胞转染效率超过90%,收集细胞。将对照组,si RNA组,和阴性对照组的细胞分别用于Real-Time PCR检测My D88 m RNA和蛋白的表达状况,选出沉默效率最高的si RNA序列。测定各组细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量。测定各组PC12细胞TLR4、My D88及NF-κB m RNA,测定各组PC12细胞TLR4、My D88及p-NF-κB蛋白。采用SPSS 18.0统计软件,各组数据均用x±s表示,组间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1六味地黄丸对APP/PS1双转基因小鼠行为学影响的实验研究1.1六味地黄丸对各组小鼠Morris水迷宫定位航行实验的影响在各组小鼠水迷宫定位航行实验中,随着训练时间和次数的增加,各组潜伏期有缩短趋势。其中,APP/PS1模型组与正常组相比在各时期潜伏期均延长,有显著性差异(P<0.05)。六味地黄丸高剂量组和布洛芬组与APP/PS1模型组相比,潜伏期缩短,有显著性差异(P<0.05)。六味地黄丸低剂量组与模型组相比,潜伏期缩短,在测试第5,6,7 d有显著性差异(P<0.05)。1.2六味地黄丸对各组小鼠Morris水迷宫空间探索实验的影响在各组水迷宫空间探索实验中,与正常组相比,APP/PS1模型组在平台所在象限停留时间,百分比,穿越平台次数均降低,有显著性差异(P<0.05)。六味地黄丸低、中、高剂量组和布洛芬组与APP/PS1模型组相比,在平台所在象限停留时间,百分比,穿越平台次数均增高,有显著性差异(P<0.05)。1.3各组小鼠海马Ach、Ch AT和Ach E的含量模型组与正常组相比,Ach及Ch AT含量均降低,有显著性差异(P<0.05)。六味地黄丸低、中、高剂量组和布洛芬组与APP/PS1模型组相比,Ach及Ch AT含量均增高,有显著性差异(P<0.05)。APP/PS1模型组Ach E的含量较正常组及六味地黄丸低、中、高剂量组和布洛芬组略有增高,但无统计学差异(P>0.05)。2六味地黄丸对APP/PS1双转基因小鼠TLR4/NF-κB信号转导途径的影响2.1免疫组化法检测Aβ、GFAP、NF-κB蛋白表达情况正常对照组小鼠脑内未观察到Aβ沉积所形成的老年斑,而APP/PS1模型组海马中的老年斑(Aβ)的数量多,总面积大,经计算所得的积分光密度值高。六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组Aβ积分光密度值显著降低(P<0.01),老年斑数量减少,总面积降低。六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组星形胶质细胞活化状态明显减弱。APP/PS1模型组NF-κB蛋白表达显著增高(P<0.01),且观察到海马细胞核内呈高表达状态。2.2各组小鼠血清TNF-α和IL-1β含量的比较与正常对照组相比,APP/PS1模型组小鼠血清TNF-α和IL-1β含量增高(P<0.05)。与APP/PS1模型组相比,六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组小鼠血清TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.05),而六味地黄丸低剂量组无统计学差异(P>0.05)。2.3各组小鼠海马TLR4、My D88及NF-κB m RNA的表达情况APP/PS1模型组小鼠海马TLR4、My D88及NF-κB m RNA表达增高(P<0.05)。与APP/PS1模型组相比,六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组小鼠海马TLR4、My D88及NF-κB m RNA表达降低(P<0.05)。2.4各组小鼠海马TLR4、My D88及p-NF-κB蛋白的表达情况APP/PS1模型组小鼠海马TLR4、My D88及NF-κB蛋白表达增高(P<0.05)。与APP/PS1模型组相比,六味地黄丸中、高剂量组和西药布洛芬组小鼠海马TLR4、My D88及p-NF-κB蛋白表达降低(P<0.05)。3六味地黄丸含药血清对Aβ诱导PC12细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响3.1不同浓度Aβ25-35对PC12细胞的影响用终浓度分别为10、20、30、40μM的Aβ25-35与PC12细胞分别作用24、36、48、72h后,随着Aβ25-35浓度和作用时间的增加,细胞存活率逐渐降低,有明显的剂量、时间依赖性。与对照组(加入等体积的无菌去离子水)相比,10、20μM Aβ25-35组细胞存活率无统计学差异(P>0.05),作用效果不明显。30μM和40μM Aβ25-35组在各作用时间存活率均明显降低(P﹤0.05),其中,40μM Aβ25-35组存活率最低。3.2 si RNA干扰沉默PC12细胞My D88的表达将化学合成的三个My D88 si RNA序列以及负对照序列转染PC12细胞,通过Real-Time PCR筛选沉默效率最高的序列为My D88-3,通过western blot检测,该序列对My D88蛋白表达与对照组相比下调85±6.3%(p﹤0.01)。3.3各组PC12细胞培养基上清TNF-α和IL-1β含量的比较模型组PC12细胞培养基中TNF-α和IL-1β含量显著增高(P<0.05),含药血清组、My D88沉默组和VE组TNF-α和IL-1β含量均明显降低(P<0.05)。3.4各组PC12细胞TLR4、My D88及NF-κB m RNA的表达情况模型组PC12细胞TLR4、My D88及NF-κB m RNA表达增高(P<0.05)。与模型组相比,含药血清组、My D88沉默组和VE组TLR4、My D88及NF-κB m RNA表达降低(P<0.05)。3.5各组PC12细胞TLR4、My D88及p-NF-κB蛋白的表达情况模型组PC12细胞TLR4、My D88及NF-κB蛋白表达增高(P<0.05)。含药血清组、My D88沉默组和VE组TLR4、My D88及p-NF-κB蛋白表达降低(P<0.05)。结论:1.六味地黄丸能够使APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验潜伏期缩短,在平台所在象限停留时间,百分比,穿越平台次数均增高。六味地黄丸能够明显改善小鼠学习记忆障碍。2.APP/PS1双转基因小鼠海马出现大量Aβ沉积所致的老年斑,六味地黄丸能够有效降低其Aβ沉积,抑制As的过度激活。3.六味地黄丸能够抑制TLR4/NF-κB信号转导途径,降低TNF-α和IL-1β的表达,从而通过减轻中枢免疫炎症反应,发挥抗AD的作用。4.My D88沉默后,TLR4/NF-κB下游因子NF-κB m RNA和蛋白表达均降低,My D88介导的TLR4/NF-κB信号途径的激活是AD中枢免疫炎症反应的重要机制,为六味地黄丸从肾论治AD的理论提供实验支撑。