论文部分内容阅读
为了使不同实验室的结果具有可比性,精液分析的标准化和质量控制必不可少。本研究首先根据对我国目前男科实验室的了解以及WHO手册制定了“男科实验室精液分析调查表”,此表共有36个问题,涉及样本收集、分析方法、结果报告、方法评价等各个方面。调查结果显示,在中国,男科实验室精液分析的方法和报告方式很不统一,许多方法与WHO手册推荐的方法也不一致。而且,国内没有一家单位开展精液分析的室内和室间质量控制。提示,目前男科实验室精液分析方法急需标准化和质量控制。
首先,我们对精浆生化指标α葡糖苷酶、果糖和酸性磷酸酶(ACP)的标准化和质量控制进行了研究。在精浆α葡糖苷酶检测中,3000 g离心15 min后的精浆α葡糖苷酶水平显著低于1000 g离心10 min后的精浆α葡糖苷酶水平(P:0.001)。随着禁欲时间的延长,精浆α葡糖苷酶水平不断升高。在精浆果糖检测中,果糖标准液在配置后的第3~4周相对稳定。精浆放置不同时间后的果糖浓度没有显著性差异(P>0.05)。但随着精液放置时间的延长,果糖浓度不断降低,且精液果糖浓度的降低与活动精子密度呈显著正相关。不同速度离心后的精浆精子密度有显著性差异,但精浆果糖浓度没有显著性差异。在精浆ACP检测中,精浆稀释后放置半小时所测ACP活性显著低于稀释后立即检测的水平(P=0.001)。不同速度离心后的精浆精子密度有显著性差异,但精浆ACP活性没有显著性差异。糜蛋白酶、苯甲基磺酰氟(PMSF)和冻融对精浆α葡糖苷酶、果糖和ACP水平均没有影响。提示,精浆生化指标检测中,离心速度、禁欲时间、精液放置时间等均需要标准化,且冻融精浆可以作为常规实验室的质控品。
精子密度分析标准化的关键是计数池的标准化。本研究中,我们评价了血球计数池、Cell-VU计数池及Makler计数池的准确性和精确性。我们使用3种计数池对两种不同浓度[浓度分别为(35±5)×106/ml和(18±2.5)×106/ml]的标准乳胶珠溶液中的乳胶珠浓度,高、中、低浓度的精子悬液和精液中的精子浓度、以及随机精子悬液和精液样本分别进行了计数。结果显示,Cell-VU计数池的结果最接近标准乳胶珠溶液的参考浓度,而血球计数池和Makler计数池明显高估乳胶珠浓度。不同浓度精子悬液和精液的精子计数结果与标准乳胶珠溶液类似,提示,3种计数池中Cell-VU计数池的准确性和精确性最好。文献报道,流式细胞术可用作精子密度分析的参考方法。因此,我们进一步用流式细胞术、Cell-VU和计算机辅助精液分析(CASA)系统分析了85例精液样本的精子密度,并用流式细胞术检测了两种不同浓度的标准乳胶珠溶液的珠浓度。结果显示,流式细胞术分析标准乳胶珠溶液的变异系数和相对误差分别为3.84%、31.3%和4%、15.51%。与Cell-VU计数池相比,流式细胞术高估精子密度达109%。而且,流式细胞术分析无精子症样本的精子密度为0.12(0.04~0.24)×106/ml。提示,流式细胞术不适合用于精子密度分析,尤其是无精子症样本分析。另外,我们尝试制备了精子密度分析的质控品,并对其精子密度连续分析4周,结果显示,高、低精子密度的精液样本反复冻融5次以内,不会影响精子密度分析结果。
精子形态学分析是评价精子质量的重要指标之一。本研究中,我们用目前国内外常用的6种精子染色方法,即改良巴氏染色法、苏木精—伊红(HE)染色法、瑞氏染色法、瑞一吉氏染色法、Diff—Quik染色法和Shorr染色法,对25例精子涂片分别进行了染色,并用CASA系统对精子长轴、短轴、面积、周长、长宽比和顶体比进行了分析,同时比较了染色效果。结果显示,6种染色方法中,瑞—吉氏和瑞氏染色法的精子头的长轴和短轴最高,其次为Diff—Quik染色法,巴氏染色法的精子头的长轴和短轴最低,而HE和Shorr染色法的精子头长轴和短轴介于巴氏染色法和Diff—Quik染色法之间。精子面积和周长有相同的变化趋势。6种精子染色方法的染色效果亦不同,Diff—Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶体和核,其次为 HE 染色法,而巴氏、瑞氏和瑞—吉氏染色的精子项体和核分界不明显。基于不同染色方法对精子头大小的影响、染色效果以及操作的简易程度,我们认为Diff—Quik和Shorr染色法比较适合于精子形态学分析,可以作为精子形态学分析的标准方法。
为了建立标准化的抗精子抗体酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测系统,我
们首先比较了国内外4种抗精子抗体检测试剂盒,共分析血清标本159例,结果显示,不同来源的ELISA检测试剂盒检测结果差异较大,检测的抗精子抗体阳性率为5.13%~60.38%,相差近12倍。而且,各自的阴、阳性对照很难被其他检测试剂盒重复,不同检测试剂盒之间的结果一致性很低,仅为34.62%~67.92%。随后,我们用正常生育男性精子免疫家兔所得抗血清,通过噬菌体展示技术筛选出16个阳性克隆,经BLAST分析,得到4个与男性生殖活动密切相关的精子抗原模拟表位,并对其中2个表位进行了合成,建立了以这两个多肽为精子特异性抗原的ELISA法,并分析了134例血清标本和74例精浆标本,血清标本的抗精子抗体阳性率分别为20.15%和11.1996,两者一致性为91.04%,精浆标本的抗精子抗体阳性率均为1.35%,一致性为10096。由此认为,模拟精子抗原表位可以作为标准的精子特异性抗原用于建立抗精子抗体检测的ELISA法。
在上述研究的基础上,我们率先在南京市调查并分析了各家医院对精液分析项目中的精子密度、精浆果糖、α葡糖苷酶及ACP的检测结果。结果显示,8份质控品分装后检测的CV为3.83%~11.16%。11家医院回报的精子密度结果11份,精浆α葡糖苷酶、果糖和ACP结果5份。不同实验室精浆果糖浓度的检测结果差异最小(CV分别为8.99%和3.95%),其次为α葡糖苷酶(CV分别为16.66%和18.41%),而精浆ACP的检测结果差异最大,CV分别为54.12%和65.58%。RE亦有相同的趋势。11家医院中,6家用计算机辅助精液分析(CASA)系统检测精子密度,5家用改良牛鲍氏血球计数池的方法检测。血球计数池计数的精子密度结果[分别为(62.74±16.63)×106/ml和(163.32±36.24)×106/ml]和RE值(分别为148.47%和187.59%)显著高于CASA系统检测的结果[分别为(24.88±4.16)×106/ml和(54.24±23.06)×106/ml]和RE值(分别为13.97%和10.4896)。提示,目前男科学实验室精浆α葡糖苷酶和果糖的检测方法比较稳定,结果的变异在可接受的范围内,而 ACP 检测的方法可能不适合于临床常规使用,尚需进一步改进。血球计数池明显高估精子密度,不适合用作精子密度分析。