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第一部分可放射诱导的肿瘤特异性嵌合启动子的构建及活性检测目的：将放射敏感性的CArG元件与肿瘤特异性的人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因启动子相结合,构建新型的嵌合启动子,并检测嵌合启动子的放射诱导性和肿瘤特异性,以探讨其在基因治疗中的作用。方法：分别构建含有4、6、8、10个CArG元件的增强子,插入肿瘤特异性的hTERT核心启动子上游,构建成新型的嵌合启动子质粒,分别为pC4-hTERT-luc, pC6-hTERT-luc, pC8-hTERR-luc, pC10-hTERT-luc,同时以包含SV40启动子的质粒(pControl-luc)为对照。将构建的质粒转染至人宫颈鳞癌HeLa细胞、人肺腺癌A549细胞、人肝癌MHCC97细胞和正常细胞人胚肺细胞hEL中,在不同剂量放射线诱导下,利用荧光素酶报告基因检测嵌合启动子在肿瘤及正常细胞中的活性。同时我们还比较了不同照射方式,即单剂量照射(一次6Gy)与分割照射(3×2Gy)对嵌合启动子诱导效果的影响。结果：包含6个CArG元件的嵌合启动子较含其他数量CArG元件的嵌合启动子显示了更好的放射诱导性,甚至高于阳性对照质粒pControl-luc(P<0.05),并在4-6Gy时达到顶峰,而构建的嵌合启动子在正常的hEL细胞中活性很低。比较单剂量和分割照射剂量对嵌合启动子活性诱导差别时,3次2Gy与单次6Gy剂量照射相比较,报告基因的表达无统计学差异(P>0.05)。结论：包含6个CArG元件的肿瘤特异性嵌合启动子具备很好的放射反应性,这种嵌合的启动子系统具有相当的肿瘤基因治疗的潜力。第二部分新型的嵌合启动子介导的自杀基因治疗的体外研究目的：检测利用新型的嵌合启动子介导的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)/吲哚乙酸(indole-3-acetic,IAA)自杀基因系统,与放射治疗相结合,对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。方法：我们筛选出含有6个CArG元件的hTERT嵌合启动子做后续基因治疗研究,将HRP基因表达片段插入嵌和启动子的下游,构建新的表达载体pC6-hTERT-HRP,同时构建phTERT-HRP为单启动子对照质粒,pControl-HRP为阳性对照质粒,和pControl-luc为阴性对照质粒。将构建的质粒瞬时转染至肿瘤细胞(HeLa, A549, MHCC97)和正常细胞(hEL)后,在6Gy放射线诱导下,利用Western blotting检测HRP的表达。利用MTS实验、Annexin V-FITC染色检测此嵌合启动子质粒系统联合前药IAA,对细胞的生长抑制及凋亡诱导效应,利用克隆形成实验检测此系统对肿瘤细胞放射敏感性的影响。结果：三种肿瘤细胞经转染后,可见明显的HRP蛋白表达,并且在6Gy放射线诱导下,HRP表达量明显增多。而在人胚肺细胞hEL中,仅pControl-HRP可见HRP表达。在放射线诱导下,嵌和启动子介导的自杀基因HRP/IAA系统显示了较对照更强的对肿瘤细胞增殖抑制和凋亡诱导效应,甚至高于阳性对照质粒(P<0.05)。而在正常hEL中,C6-hTERT-HRP/IAA与放射相联合,引起的生长抑制和凋亡效应明显低于阳性对照质粒(P<0.05)。克隆形成实验显示嵌合启动子系统对肿瘤细胞的放射增敏比值也更高,甚至高于阳性对照质粒,嵌合启动子系统对三种肿瘤细胞(HeLa、A549、和MHCC97)的放射增敏比分别为3.35,3.45,3.45。结论：体外研究表明这种嵌合的启动子系统提供了新的肿瘤治疗模式,具有相当的肿瘤治疗的潜力。第三部分新型的嵌合启动子介导的自杀基因治疗的体内研究目的：构建包含嵌和启动子的复制缺陷型腺病毒载体,在放射线诱导下,检测其对肝癌裸鼠种植瘤的杀伤作用。方法：构建含有嵌合启动子调控自杀基因表达的复制缺陷型腺病毒载体Ad-C6-hTERT-HRP,以阴性病毒载体Ad-CMV-GFP为对照载体。将人肝癌细胞MHCC97接种至裸鼠BALB/C左侧腋下皮下,建立肝癌裸鼠移植瘤模型。种植后第11d,14d,17d瘤内注射腺病毒液,第13d至27d腹腔注射前药IAA。同时在瘤内注射的次日给与或不给放射处理,检测裸鼠皮下移植瘤体积,及观察荷瘤裸鼠生存期。种植后8周处死所有老鼠,取正常器官(肺、肝脏、肾脏、小肠)的进行常规病理学HE染色,取肿瘤组织进行TUNEL检测细胞凋亡。结果：包含嵌和启动子的腺病毒载体联合放疗对移植瘤生长抑制作用最强,并且在种植后第5周,Ad-C6-hTERT-HRP联合放疗组的相对肿瘤体积明显小于对照病毒组(P<0.05)。Ad-C6-hTERT-HRP联合放疗组较其他对照组能明显延长裸鼠中位生存期(P<0.05),其中位生存期为54.2天。TUNEL结果显示嵌合启动子联合放疗所致移植瘤的凋亡率高于其他对照组(P<0.05)。光镜下观察各治疗正常器官组织,未发现治疗相关毒性副反应改变。结论：复制缺陷型腺病毒介导的靶向自杀基因治疗联合放疗能有效抑制肝癌皮下移植瘤生长,延长裸鼠生存期,为肝癌的治疗提供了新的途径,具有良好的应用前景。