胃癌是我国最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率仍居首位,每年约有40余万人患胃癌,而死于胃癌者多达30余万,大大高于欧美发达国家。目前,传统的手术治疗、放射治疗、化疗治疗等疗效较差、易复发、副反应严重,5年生存率仅为30%左右。因此,提高5年生存率,探索治疗胃癌的新方法,寻找新一代更有效、低毒和价廉的抗肿瘤药物,一直是亟待解决的课题。现在,逆转人胃癌细胞的研究已成为生命科学研究前沿领域。二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）是大蒜中的一种脂溶性的有效成分,对乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌和白血病等多种肿瘤均有明显的抑制作用,是一种很有开发潜力的抗肿瘤候选药物。【DADS诱导人胃癌细胞增殖抑制、分化与周期阻滞的研究】本研究采用MTT法、电镜观察、Con A凝集实验、碱性磷酸酶（ALP）比活性测定、骨架蛋白细胞化学、划痕标记荧光染料示踪技术（SLDT）、免疫组化等方法,观察DADS对体外培养的人胃癌MGC803细胞的生长抑制与诱导分化效应。MTT比色实验结果显示,DADS浓度从20、25、30到35mg·L^-1处理人胃癌MGC803细胞,其吸光值比对照组低,而且随浓度增加逐渐降低（P<0.05）;相反,随着浓度增加,DADS对癌细胞增殖的抑制率从11.3%、35.2%、50.7%到60.6%逐渐增强（P<0.05）,表明DADS对人胃癌细胞具有明显的生长抑制作用,且呈显著的剂量-效应依赖关系。电镜观察发现30mg·L^-1DADS引起瘤细胞异型性降低,核质比下降,细胞表面微绒毛数目减少,胞浆内细胞器丰富,胞核及部分细胞器呈退行性变,并可见细胞间连接结构;DADS处理后瘤细胞对Con A的凝集率从79.10%降为26.98%（P<0.05）;ALP比活性由0.120 U/g下降至0.040 U/g（P<0.05）,下降率为66.12%;骨架蛋白细胞化学研究表明,细胞骨架蛋白合成增加与重组,划痕标记染料示踪技术（SLDT）显示细胞间缝隙连接通讯功能得以恢复;免疫组化发现,DADS处理后的MGC803细胞p21WAF1表达增强,p21ras、c-Myc、突变型p53表达减弱而pRb的表达没有改变。上述结果提示,DADS可诱导人胃癌MGC803细胞增殖抑制与分化。DADS对人胃癌BGC823细胞也具有一样的生长抑制效应,且呈显著的剂量-效应依赖关系（P<0.05）。流式细胞分析表明,DADS可将MGC803和BGC823细胞阻滞在G₂/M期。DADS作用12 h时,G₂/M期细胞分别增加到35.7%和30.1%;24 h时,分别增加到51.7和58.1%;36h时,分别达58.7%和50.2%（P<0.05）。Western Blot结果显示,20、25、30、35mg·L^-1DADS处理,呈浓度依赖性抑制人胃癌细胞中ERK的活化（P<0.05）;并且DADS +MEK抑制剂U0126能完全阻断ERK活化（P<0.05）;时间效应上,30mg·L^-1DADS处理后15-30min抑制作用最强,2h左右恢复正常（P<0.05）。提示DADS抑制ERK通路可能是诱导人胃癌细胞增殖抑制与分化的重要分子机制。结论:DADS具有诱导人胃癌细胞分化及抑制增殖的作用。DADS诱导人胃癌细胞增殖抑制和分化与细胞周期G₂/M期阻滞有关。ERK活性抑制是DADS诱导人胃癌细胞分化与抑制增殖的重要分子机制之一。【DADS对人胃癌MGC803和BGC823细胞G₂/M期检查点激酶通路的影响】肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱的一类疾病,周期调控机制失活,特别是G1/S和G₂/M期检测点（checkpoint）的失活在细胞癌变过程中起着至关重要的作用。采用药物激活细胞周期调控机制,从而诱导肿瘤细胞凋亡和分化已成为肿瘤治疗的一个可行的新途径。前期工作证实,DADS对人胃癌MGC803细胞周期的作用可能与调节Cdc25C、cyclinB1蛋白的表达有关。本实验发现,DADS呈时间依赖性抑制人胃癌BGC823细胞周期Cdc25C磷酸酶的表达,cyclinB1表达在DADS处理24 h后开始下降,其改变与MGC803细胞中的一致。Cdc25C作用于cyclinB1/ CDK1复合物,而其磷酸酶活性受细胞周期检查点Chk1和/或Chk2激酶调节。本研究显示,30mg·L^-1DADS分别刺激1h和2h后,MGC803和BGC823细胞磷酸化Chk1表达明显增加,并呈时间依赖性（P<0.05）,提示DADS对两种细胞中的磷酸化Chk1的作用相仿,而人胃癌MGC803和BGC823细胞处理组与未处理组磷酸化Chk2表达无明显差异（P>0.05）;总Chk1和Chk2蛋白表达在两种细胞处理前后均无改变（P>0.05）。RT-PCR检测发现,Chkl和Chk2 mRNA水平在处理组与未处理组之间无明显差异（P>0.05）,表明DADS只对蛋白磷酸化有影响,而对其mRNA水平无影响。以上结果提示,DADS是通过激活Chk1而不是Chk2调节Cdc25C、cyclinB1的改变。Chk1是ATR的下游分子,我们进一步检测ATR的活性,结果显示,磷酸化ATR在MGC803和BGC823细胞中未处理组无表达,DADS处理15min后被激活,并呈时间依赖性（P<0.05）,而ATR总蛋白表达均无改变,这进一步说明DADS可能是通过ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1引起细胞周期G₂/M阻滞。免疫共沉淀分析结果表明,MGC803和BGC823细胞中DADS能促进Chk1与Cdc25C结合,而对Chk2与Cdc25C结合无影响,证明DADS作用的周期信号通路是Chk1/Cdc25C,而不是Chk2/Cdc25C。结论:DADS可能是通过靶向检查点激酶Chk1引起G₂/M期阻滞。DADS阻滞人胃癌细胞于G₂/M期与调节ATR/ Chk1/ Cdc25C/ cyclin B1信号通路有关,可能成为治疗胃癌的新靶点。【Chk1和Chk2基因沉默对DADS G₂/M期阻滞作用及检查点激酶通路的影响】RNAi（RNA interference）是转录后基因沉默的一种调控机制,是机体固有的对抗外源侵袭基因及维持自身基因稳定性的一种自我保护机制。本研究采用RNAi技术分别在MGC803和BGC823细胞中将Chk1、Chk2基因沉默,进一步确定DADS的作用靶点。将Chk1、Chk2 RNAi分别转染MGC803和BGC823细胞后,Western blot和实时荧光定量PCR验证结果显示,MGC803和BGC823细胞Chk1 mRNA表达分别被抑制76.0%和84.7%,蛋白表达分别下降85.0%和90.2%;chk2 mRNA表达分别降低84.1%和69.0%,蛋白表达分别下调83.4%和93.5%。MTT结果发现,Chk1基因沉默后,对MGC803和BGC823细胞增殖有明显抑制作用,其抑制率分别为38%和48.1%（P<0.05）,而加以30mg·L^-1DADS后,其抑制率分别增加至56.3%和68.4%,与Chk1基因未沉默而用30mg·L^-1DADS处理组无差异（P>0.05）。相反,Chk2基因沉默后对细胞增殖无明显抑制作用（P>0.05）。流式细胞术分析Chk1和Chk2基因沉默后对BGC823细胞周期的影响,发现Chk1基因沉默后G₂期明显比未处理组减少12.5%（P<0.05）,Chk2基因沉默后G₂期下降8.1%（P>0.05）,Chk1和Chk2基因同时沉默G₂期下降13.6%（P<0.05）,与Chk1基因单独沉默的影响接近（P>0.05）。Chk1基因沉默后加入DADS后,在24h、48h,G₂期分别为10.4%、17.1%,与未处理组18.6%、20.4%比较,对细胞周期G₂期影响不大（P>0.05）,但较处理组58.1%、36.2%G₂期,分别下降47.7%、19.1%（P<0.05）,这表明DADS的作用靶点可能是Chk1。Chk1和Chk2下游分子的改变显示,Chk1基因沉默后Cdc25C和cyclinB1表达较未处理组明显增加,而加入DADS后,Cdc25C和cyclinB1表达与未处理组相比无差异;但Chk2基因沉默后对Cdc25C和cyclinB1表达无影响,对DADS的作用无影响,证实DADS的主要作用靶点是Chk1而不是Chk2。结论:Chk1基因沉默可明显抑制人胃癌细胞增殖。DADS阻滞G₂/M期是通过Chk1/Cdc25C/cyclinB1信号通路起作用,其主要作用靶点是Chk1。Chk2不参与DADS对胃癌G₂/M期的阻滞作用。