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糖尿病血管病变是糖尿病发病率和死亡率居高的重要因素。糖尿病影响血管功能,导致胰腺、肾、视网膜及神经等微血管并发症。内皮功能障碍是加速糖尿病血管病变的始发因素并与糖尿病血管并发症的发病机制密切相关,主要表现为血管舒张因子与血管收缩因子之间的失衡。内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是作用最强的血管收缩因子,亦是参与糖尿病血管病变发生及加速血管并发症的重要因素。然而,迄今为止ET-1对糖尿病微血管的作用机制尚不明确,而对小血管和微血管的深入研究更能揭示糖尿病及其血管并发症的病理机制。越来越多的人体或动物实验证实糖尿病状态下存在明显的氧化还原平衡失衡,活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)过量产生是其主要特点,主要包括超氧阴离子(Superoxide anion, O2-)和过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2).二者作为体内主要的氧化还原代谢产物,并作为重要的信息传递分子影响血管活性。糖尿病状态下的O2.-及H202基础水平均明显升高,ET-1进一步刺激组织释放O2.-ET-1刺激培养的肺动脉内皮细胞,导致细胞内过氧化氢酶活性降低以及H2O2聚集,进而影响肺血流量。这些研究强烈提示氧化应激参与血管对ET-1的反应性。糖尿病动物模型体内存在Wnt信号通路蛋白表达的异常,如Wnt5a和β-catenin表达量的下降。有文献显示,转染特异的经典w nt信号通路抑制剂Dickkopf 1 (DKK1)能显著增加ROS水平。Nucleoredoxin (NRX)作为硫氧还原蛋白家族的重要成员,通过作用于散乱蛋白(Dishevelled, Dvl),负性调控Wnt信号通路。研究表明,H2O2可以抑制环连蛋白(p-catenin)/T细胞因子(T cell factor, TCF)的转录活性,高表达Dvl能改善这种抑制作用。比较有趣的是,也有研究报道了截然相反的结果,即H2O2作用于细胞后增加了糖原合成激酶-3β(Glycogensynthase kinase-3p, GSK3p)的去磷酸化,并暂时性激活TCF.以上研究结果均表明Wnt信号通路与氧化应激之间存在一定的关联。那么,糖尿病模型小鼠肾小球入球动脉对ET-1的反应性是否增强?增强的ET-1反应性是否与氧化应激异常相关?糖尿病动物模型是否存在经典Wnt/β-catenin通路的异常?经典Wnt/β-catenin信号通路与氧化应激是否存在关联?采用Wnt信号通路特异性抑制剂能否削弱糖尿病状态下增强的ET-1反应性?针对这些问题,本课题采用世界尖端的、国内首创的微动脉微灌注技术,集中研究糖尿病动物模型及培养的人脐静脉内皮细胞中Wnt/β-catenin通路与氧化应激相关分子的关系,以探讨糖尿病血管并发症的相关分子机制。第一部分：氧化应激在糖尿病小鼠肾小球入球动脉对内皮素-1反应性中的作用目的：本研究通过构建C57BL/6小鼠糖尿病模型,探讨该模型下小鼠肾小球入球动脉对内皮素-1的反应性及氧化应激作用机制。方法：1.通过给C57BL/6小鼠腹腔注射链脲佐菌素(70 mg/kg/d)连续四天,构建糖尿小鼠模型,腹腔注射等体积枸橼酸-枸橼酸钠的C57BL/6小鼠作为正常对照组,每组均为10只。2.采用世界尖端的、国内首创的、难度较高的显微微灌注技术比较两组小鼠肾小球入球动脉对ET-1的反应性,并确定不同类型ET-1受体的作用。3.采用不同类型ROS清除剂孵育两组小鼠肾小球入球动脉,探明H2O2和O2-在不同条件介导的ET-1血管反应性中的作用。4.比较两组小鼠肾小球入球动脉在不同的时间点对H2O2 (10μM的反应性。5.采用荧光探针法检测显微微灌注的两组小鼠肾小球入球动脉中的基础及ET-1刺激下的ROS荧光信号。6.采用、Vestern blot法检测两组小鼠球前动脉中ETA和ETB受体蛋白表达。结果：1.糖尿病条件下,肾小球入球动脉对ET-1的反应性增强,且增强的反应主要由ETB受体调节；正常条件下的ET-1血管反应性主要由ETA受体调节。2.糖尿病条件下,球前动脉ETA和ETB受体蛋白表达均明显增多。3.糖尿病条件下,H2O2和O2·-均参与增强的ET-1血管反应性。4.H2O2呈时间依赖性收缩糖尿病条件下的肾小球入球动脉。5.糖尿病条件下基础的H2O2和O2·-荧光增多,ET-1呈浓度依赖性方式诱导更多的O2,但不影响H202的释放。结论：本研究表明,糖尿病增强肾小球入球动脉对ET-1的反应性,且这种效应主要由ETB受体调节,H2O2和O2.-共同参与此过程。ET-1能促进肾小球入球动脉O2.-释放,但不影响H202的释放。第二部分：经典Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病小鼠内皮素-1血管反应性中的作用及对氧化应激水平的影响目的：本研究探讨经典Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病模型小鼠ET-1血管反应性中的作用及对氧化应激水平的影响。方法：1.C57BL/6小鼠糖尿病模型构建成功第二天开始给予舒林酸(sulindac)处理,按照40mg/kg/d剂量灌胃给药,连续四周,同期对照组接受等量等体积sulindac。实验共分成四组：对照组(Control组),对照组+sulindac (Control+S组),糖尿病组(DM组)及糖尿病组+sulindac (DM+S组),每组均为10只。2.采用Western blot和real-time PCR法检测不同模型小鼠球前动脉中Wnt信号分子的表达。3.采用Western blot和real-time PCR法检测不同模型小鼠球前动脉中抗氧化应激分子的表达,评估Wnt信号通路在抗氧化应激水平的作用。4.比较不同模型小鼠球前动脉中H2O2和O2.-浓度及过氧化氢酶(CAT)和总超氧化物歧化酶(SOD)活力大小,评估Wnt信号通路的功能。5.采用显微微灌注技术比较不同模型小鼠肾小球入球动脉对ET-1的血管反应性。6.采用荧光探针法检测显微微灌注的不同模型小鼠肾小球入球动脉中的基础和ET-1刺激下的ROS荧光信号,评估Wnt信号通路的功能。结果：1.糖尿病激活经典Wnt信号通路,抑制Wnt信号通路后氧化应激分子H202和O2-含量减少,catalase和总SOD酶活力回升,抗氧化应激蛋白分子catalase和SOD2表达上调。2.Sulindac通过减少糖尿病下增多的H2O2和02"-,削弱增强的ET-1血管反应性。结论：本研究表明,糖尿病激活经典Wnt信号通路,抑制该通路活性后,H2O2和O2·-释放减少,从而削弱了增强的ET-1血管反应性。第三部分：高糖处理的人脐静脉内皮细胞经典Wnt/p-catenin信号通路上调氧化应激水平目的：高糖培养人脐静脉内皮细胞,探讨经典Wnt/β-catenin信号通路与氧化应激在糖尿病发生过程中的作用。方法：1.HUVECs中加入不同浓度葡萄糖(5.5,25,50,75,100 mM)培养24或48 h;加入不同浓度sulindac (0.15,0.25,0.5 mM)培养24或48 h；在高糖(50 mM)培养24或48 h的基础上加入不同浓度sulindac (0.15,0.25,0.5 mM)继续培养1 h。2.葡萄糖或sulindac或葡萄糖+sulindac处理后,行细胞活力检测确定二者理想浓度。3.葡萄糖或葡萄糖+sulindac处理后,采用Western blot知real-time PCR法检测各组细胞中Wnt信号分子的表达,并设立26.5 mM甘露醇作为对照组排除渗透压所带来的影响。4.葡萄糖或葡萄糖+sulindac处理后,采用Western blot和real-time PCR法检测各组细胞中抗氧化应激分子的表达,评估Wnt信号通路在抗氧化应激水平的作用。5.葡萄糖或葡萄糖+sulindac处理后,检测细胞中LOS荧光信号,评估Wnt信号通路的功能。6.葡萄糖+sulindac处理后,加入tempol (1 mM)作用1 h,采用、Vestern blot法检测各组细胞中抗氧化应激分子及Wnt信号通路相关蛋白的表达,评估氧化应激影响Wnt信号通路活性的变化。结果：1.葡萄糖呈浓度依赖性减少HUVECs活力,05 mM sulindac作用后恢复HUVECs低活力状态。2.50 mM葡萄糖作用HUVECs 24或48 h模拟糖尿病高氧化应激,经典Wnt信号通路被激活。抑制Wnt信号通路后,细胞中H2O2和O2·-释放减少,catalase和SOD2表达上调,此作用独立于渗透压变化。3. Tempol增加高糖所致的SOD2低表达,不影响catalase表达,不影响经典Wnt信号通路蛋白的表达。结论：本研究表明,高糖激活经典Wnt信号通路,抑制该通路活性后,H2O2和O2·-释放减少,抗氧化因子分子catalase和SOD2表达上调。抗氧化剂tempol不影响经典Wnt信号通路蛋白的表达。