论文部分内容阅读
对虾养殖业中危害最严重的病原是白斑综合征病毒(简称WSSV)。然而它在全球蔓延近20多年来,各国一直未研制出适于生产中规模应用的药物。我们研究集体10多年来一直用转vp28基因型蓝藻(又名蓝细菌)制备口服疫苗。其中用转vp28基因型鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)制备的口服疫苗已通过中试验收。为了进一步产业化尚需在有药效基础上提高其藻细胞产率、vp28基因表达效率以及易于定性鉴定转基因型和野生型细胞定量检测vp28含量等问题。本学位研究选用聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC 7942)来制备口服疫苗,并在改善上述几方面问题上,取得了下述3方面进展:1、通过实时荧光定量qPCR方法检测这株转vp28基因聚球藻7942中vp28基因在其各个不同生长时期中的表达效率,使用血球计数板测定其生长曲线,并通过氧电极的方法测得转vp28基因型聚球藻的净光合对不同温度、光照、pH和盐度的响应,由此确定它的最适生长条件。结果表明vp28基因在聚球藻7942中表达效率最高为9.52%,是在鱼腥藻7120表达效率的三倍。最适采收时间是对数生长后期(15d左右)。转基因型蓝藻7942的最适生长条件是:温度为40℃,盐度为0-0.1 mol/L Nacl,pH为7.5,光强450μmol·m-2·s-1。2、根据eGFP蛋白在受紫外光或蓝光激发后具有绿色荧光的特性,构建同时表达2个蛋白的穿梭质粒载体pRL489-vp28-egfp,并通过三亲结合法转化聚球藻7942,筛选后用液相氧电极法测定转vp28-egfp基因型聚球藻的最适生长条件:温度为40℃;盐度为0-0.2 Nacl mol/L;pH为8.0;最适光强范围为400-600μmol·m-2·s-1;在最适光强时,转基因型藻比野生型的净光合提高了12.6%。大量培养后,用转vp28-egfp基因型聚球藻作为免疫口服剂,对南美白对虾进行药效实验表明两个实验组累积死亡率分别为25%,即累积存活率分别为75%,其他各组的累积死亡率均为100%。这个对虾苗的保护率比转基因型鱼腥藻亚单位疫苗的高7%。3、用Illumina nextseq 500二代高通量测序法分析转vp28基因型聚球藻7942转录组,然后进行了测序数据质量情况汇总、转vp28型聚球藻7942表达差异分析。结果表明,vp28基因转入聚球藻7942后,上调了84个基因的表达,下调了39个基因的表达。在基于KEGG通路的光合作用分析,和基于氧电极的光合作用验证和转录本结构分析与优化。在KEGG通路分析中,发掘了光系统I中PsaD外周蛋白的通路上调,并通过分析转vp28聚球藻的光合作用速率来验证PsaD外周蛋白的作用。结果表明,在转vp28基因聚球藻7942的KEGG代谢通路中,较对照组,其光系统I中PsaD蛋白的代谢通路上调,PsaD蛋白与带有负电荷的铁硫蛋白Fd之间的静电互相作用,可为Fd提供必要的联结位点。