人胚中脑神经干细胞及骨髓基质细胞移植治疗恒河猴帕金森病模型的实验研究 对于神经干细胞（neural stem cell）移植治疗帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的临床前期研究，近年来研究者通常执行的方案为以下4步：1源于胎脑组织的神经干细胞的分离与纯化；2神经干细胞的体外增殖，使之达到满足于移植所需的数量；3神经干细胞的定向分化；4移植方法的选择。的确在按上述方式进行的动物实验结果表明神经干细胞与宿主移植区的神经细胞有较好的整合性，并可以看见有多巴胺能神经元（Dopaminergic neurons, DA）的产生，实验动物（主要是啮齿类）的行为学检测的确有较好的表现，但依旧存在多巴胺能神经元分化率较低的问题，不能从根本上改善帕金森病的症状，而且大多数研究者采用的神经干细胞移植供体、实验动物的选择及帕金森病模型的制作方式不同造成实验动物移植后出现结果的参差不齐，并且多数实验技术较为复杂，导致所产生的实验数据很难应用于临床的前期准备及早期临床实验研究。 因此针对既往的研究，本课题拟从以下实验步骤进行临床前期研究：第一步——甄选有效的神经干细胞移植供体；拟从人胚脑组织富含神经干细胞的纹状体、海马、额叶脑室旁区、中脑腹侧等脑区分离神经干细胞，以人胚骨髓基质细胞、两种干细胞的共培养体系及其他作用因子纯化并诱导神经干细胞定向分化为DA能神经元，根据DA能神经元的诱导率选择合适的神经干细胞作为移植供体。第二部分——选择正确的帕金森病恒河猴模型制作方式；因既往的动物模型制作集中于啮齿类动物，灵长类动物很少涉及，故此部分将根据本课题的预实验选择立体定向技术下6—羟多巴胺（6—OHDA）单侧黑质毁损术制作偏侧帕金森病恒河猴模型，使之更接近于临床病理特征，并且简化操作程序使模型制作方法具备较好的可重复性。第三部分——神经干细胞的立体定向技术下移植治疗，在此部分中以第一部分结果选择的神经干细胞作为移植供体同时选择纯化的人胚骨髓基质细胞移植供体作为实验对照，术后主要通过恒河猴移植区多巴胺转运蛋白（Dopamine transport, DAT）的放射性核素⁹⁹mTc-TRODAT-1 SPECT显像及移植供体分化后脑组织的免疫荧光检测以及动物术后行为学改变客观的评价两种干细胞的移植功效，根据这些实验结果正确的选择移植供体及符合临床病理的动物模型制作方式，以此为临床治疗提供有价值的实验数据。中文摘要第一部分人胚神经干细胞与骨髓基质细胞的培养及定向诱导分化 目的 分离来自人胚纹状体、海马、额叶、中脑的神经干细胞及四肢管状骨的骨髓基质细胞并纯化，建立共培养系统诱导神经干细胞的DA能神经元分化，根据诱导率来筛选合适的恒河猴帕金森病的移植治疗移植供体。 材料与方法 选用8一16周的流产人胚，分离纹状体、海马、额叶、中脑的神经干细胞及骨髓基质细胞并纯化，将纯化的P9代骨髓基质细胞与以上各种神经干细胞建立共培养系统，以共培养系统本身及其提取的数种限制型培养液CM、CO一CM与bFGF再次诱导纯化后的神经干细胞分化，以免疫荧光TH（Tyrosine Hydroxylase，酪胺酸经化酶，多巴胺能神经元特异性抗原）、p一Tub lin（神经元特异性抗原）染色分析纹状体、海马、额叶、中脑神经干细胞的神经元诱导率及DA能神经元诱导率，以上数据进行Newlnan一Keuls统计学分析。 结果 经p一Tub lin免疫荧光检测发现纹状体、海马、额叶、中脑神经干细胞在bFGF、CO一CM、CM、BMSC作用下其分化为神经元的比率各不相同，其中BMSC、CO一CM作用下的神经元分化率达60一70%，明显高于其他诱导条件下的分化（只0.01）;经TH免疫荧光检测发现中脑神经干细胞在BMsc或co一CM条件下有着近40%的多巴胺能神经元分化率，明显高于其他诱导组（代0.01）。 结论 1中脑神经干细胞由于其本身所具有的区域特异性生物学特征较其他来源的神经干细胞更易向DA能神经元分化。 2骨髓基质细胞能提高纹状体、海马、额叶中脑神经干细胞的神经元分化率，同时能够诱导除额叶神经干细胞以外的神经干细胞定向分化为DA能神经元，尤以中脑神经干细胞的诱导作用最强。 3共培养系统可能诱发了骨髓基质细胞与神经干细胞之间的自分泌/旁分泌作用，从而导致了DA能神经元的诱导分化。 4中脑神经干细胞可能成为移植帕金森病恒河猴模型最合适的移植供体。