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近年来,生物催化水解腈化合物制备羧酸和酰胺引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。腈酶转化法具有反应条件温和、无污染及立体选择性好等优点,已成了诸多企业化学工艺替代的首选。2-氯烟酸由于其特殊的生物活性,作为中间体已在农药、医药和精细化学品合成中得到广泛的应用。本课题的目标是通过腈水合酶和酰胺酶双酶水解途径,发展生物催化技术在2-氯烟酸合成中的应用;利用基因工程方法构建的重组大肠杆菌分别表达单一腈水合酶和酰胺酶,研究两重组菌分别催化2-氯-3-氰基吡啶和2-氯烟酰胺为相应2-氯烟酰胺和2-氯烟酸的反应规律;建立两重组菌耦合催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸的工艺,并研究双酶共表达菌株催化制备2-氯烟酸的反应特性。论文首先根据NCBI数据库中报道的编码腈水合酶的序列设计引物,以红平红球菌Rhodococcus erythropolis ZJB-09149 基因组 DNA为模板克隆了腈水合酶基因,分析结果表明该腈水合酶αα亚基全长624 bp,编码208个氨基酸,预测分子量为22.9 KDa;β亚基全长639 bp,编码213个氨基酸,预测分子量为23.4 KDa;比对结果显示该腈水合酶氨基酸序列与NCBI中报道的Rhodococcus erythropolis SK121（ZP04388498.1）的同源性为100%;选用共表达载体pCDFduet-1,构建了含腈水合酶基因的表达质粒pCDFduet-1-NHα-NHβ并转化到大肠杆菌中,通过筛选获得表达腈水合酶的重组菌E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ,并成功检测到了腈水合酶的活性。为提高腈水合酶的催化活性,论文通过单因素实验对E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ表达腈水合酶的诱导条件进行了优化。当菌浓OD600为1.0左右时加入诱导剂IPTG浓度0.4～0.6 mM较为合适,诱导时添加Fe2+与否对产酶有较大影响;最适诱导温度为25℃,诱导时间为10～14 h,在优化条件下测得腈水合酶的活力为730 U/l,比未优化前提高了 6倍。研究了转化pH值和温度、底物浓度以及菌体密度等因素对腈水合酶催化2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酰胺的影响。结果表明,转化的最适pH为7.5,最适温度为35℃,受底物溶解度的影响较小,一次添加量可达6 mol/l,高浓度的底物和产物对水解反应有一定的抑制作用,在上述条件下,添加5 gWCW/l的菌体量,转化30 min后,2-氯烟酰胺的产率达100%。为解决酰胺酶活力不高的问题,从野生型和基因工程型菌株中筛选重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI用于催化水解2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸。对该重组菌进行诱导表达,发现诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等对酶活影响较大;通过响应面设计进一步对酰胺酶的诱导条件进行了优化,得到最佳条件为:IPTG浓度0.38 mM、诱导时间8.6 h和诱导温度22.4℃,经优化,酰胺酶活力达500.3 U/l。优化结果与实际试验结果吻合较好。分离纯化获得了电泳纯的酰胺酶,并对其酶学性质进行了研究。结果表明,最适pH为7.5,最适温度为45-50℃,该酰胺酶的热稳定性好,在40和45℃下半衰期分别达16和6 h,圆二色谱分析计算得到酰胺酶的熔点温度为62.5℃;底物特异性研究表明,该酰胺酶底物作用谱广,对芳香族和部分杂环族酰胺具有较高的水解能力。通过同源建模及分子对接技术,证实酰胺酶对不同底物之间催化能力的差异主要受通道氨基酸和底物之间的相互作用影响;研究重组酰胺酶催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸的转化过程,发现当催化剂浓度为10 g WCW/l,底物浓度为60 mM,于40 ℃,pH 7.5条件下进行转化具有最高的催化效率;通过分批流加底物的操作方法,流加底物浓度到150 mM时,产率仍可达到100%;确定了E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI静息细胞具有良好的催化稳定性,当重复使用10批次后,仍保留有50%以上的酶活。论文还研究了腈水合酶产生菌E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ 和酰胺酶产生菌E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI耦合催化水解2-氯-3-氰基吡啶制备2-氯烟酸反应的特性,考察了双菌质量比、底物浓度、温度和转速等对双菌反应体系的影响。结果表明,底物浓度对双菌催化反应有一定的抑制,2-氯-3-氰基吡啶浓度大于60 mM时,产物产率明显降低;当转化pH为7.5,温度为40 ℃,摇床转速200 rpm,E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHα-NHβ 与E.coli BL21（DE3）/pET-28b（+）-AMI静息细胞湿重比为1:2的情况下,有最高的转化效率。研究同步控制和两步控制双菌耦合制备2-氯烟酸的过程,发现同步控制双酶双菌耦合催化60 mM的2-氯-3-氰基吡啶,转化40 min后,产率即达到100%;若两步控制双酶双菌耦合催化,则上述底物浓度被完全水解的反应时间将不少于90 min。论文最后构建了共表达腈水合酶和酰胺酶的重组菌 E.coli BL21（DE3）/pCDFduet-1-NHa-NHβ/pET-28b（+）-AMI,初步优化了该重组菌的产酶条件:当菌体浓度OD600为0.6时,加入IPTG 0.4mM,24℃下诱导10 h,总酶活为28.1 U/gWCW;当2-氯-3-氰基吡啶底物浓度为10 mM,转化温度为40℃,转化50 min后,产率可达100%。