第一部分:成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为内皮样细胞和成纤维样细胞的实验研究【目的】本研究通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞,并在体外定向诱导分化为内皮样细胞和成纤维样细胞,研究其增殖和生长的特性,探讨为构建组织工程化心脏瓣膜提供种子细胞的可能性。【方法】1、成人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增:采用密度梯度离心结合贴壁的方法,提取骨髓单个核细胞进行体外培养扩增,收集传代细胞行流式细胞仪检测细胞表型,并绘制培养细胞的生长曲线。2、骨髓间充质干细胞向内皮样细胞和成纤维样细胞的诱导分化:分别用含10ng/ml VEGF和5ng/ml bFGF的培养液诱导细胞分化,对所诱导的细胞进行形态学、免疫组化染色、细胞表型及功能的鉴定。【结果】1.通过密度梯度离心结合贴壁的方法,可以获取增殖活跃的骨髓间充质干细胞,该细胞高表达CD105、CD44、CD29,原代培养曲线显示第7-10天为对数增长期,传代培养曲线显示第4-6天为对数增长期,传代细胞多于P₁₀后开始出现衰老现象。2.经VEGF诱导的细胞具有内皮样细胞形态特点,vWF染色阳性,细胞上清液内NO浓度为166.58±1.91 umol/10⁹cell/L。3.经bFGF诱导的细胞具有成纤维样细胞形态特点,SMA染色阳性,高表达CD105,不表达CD34。【结论】1.利用密度梯度离心结合贴壁的方法,可以提取足够量、高纯度、未分化、能大量增殖的骨髓间充质干细胞,能够满足构建TEHV的需要。2.骨髓间充质干细胞可以在体外诱导分化成为内皮样细胞和成纤维样细胞,并能做为构建TEHV的种子细胞。第二部分:不同方法制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架的实验研究【目的】本研究通过采用不同的洗剂来制备脱细胞的猪主动脉瓣膜支架,对比不同脱细胞方法处理后的瓣膜支架组织学结构,探讨最为有效的脱细胞瓣膜支架制备方法。【方法】将20个新鲜猪主动脉瓣膜随机平均分为新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂—酶消化组,新鲜对照组瓣膜置于4℃PBS液中备用,其余三组分别使用Triton X-100、胰蛋白酶以及二者联合的方法制备脱细胞瓣膜支架,对比观察大体形态、HE染色、Mallory-Heidenhain染色和电镜下超微结构的不同。【结果】1.经Triton X-100脱细胞处理后,瓣叶柔软,内膜光滑;HE染色可见细胞已去除,少量蓝染核物质存留,纤维排列尚规整;Mallory-Heidenhain染色示纤维结构较疏松,蓝色的胶原纤维和红色的弹性纤维相互交错;电镜下纤维结构保存尚完整,波浪状排列,原纤维横纹清楚。2.经胰蛋白酶脱细胞处理后,瓣膜有塌陷,内膜尚光滑,HE染色可见细胞完全去除,纤维排列较紊乱,局部有断裂、裂隙变大;Mallory-Heidenhain染色示纤维结构更疏松,蓝色的胶原纤维和红色的弹性纤维交织成网状;电镜下纤维交错排列,部分断裂,仍可见原纤维横纹存在。3.经Triton X-100联合胰蛋白酶脱细胞处理后,瓣叶柔软,内膜光滑;HE染色可见细胞完全去除,纤维基本连续完整,排列较规整;Mallory-Heidenhain染色示蓝色的胶原纤维和红色的弹性纤维基本平行排列;电镜下纤维保存较好,但排列较正常稀疏,原纤维横纹仍清晰可见。【结论】1.Triton X-100、胰蛋白酶以及Triton X-100联合胰蛋白酶的方法均可以有效去除供体细胞,保持纤维结构相对完整。2.三种方法比较而言,在完全清除供体细胞并保持纤维支架完整性方面,Triton X-100联合胰蛋白酶的方法更为有效。第三部分:脱细胞瓣膜支架细胞相容性和生物力学特性的实验研究【目的】本实验通过检测不同方法制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,对比其细胞相容性和生物力学特性,从而探讨更为理想的组织工程用脱细胞瓣膜支架。【方法】取去污剂组、酶消化组和去污剂—酶消化组三组脱细胞猪主动脉瓣,另取培养板做对照,种植内皮样细胞并培养7天,组织学观察细胞生长情况,MTT法描绘生长曲线。另取新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂—酶消化组四组脱细胞猪主动脉瓣,制成1.5cm×0.5cm大小的试件条,分别测定其含水量、热皱缩温度和厚度,并在生物力学测定仪上进行单轴拉伸实验、应力-松弛实验和加载-卸载实验,测定各组瓣叶的断裂强度、断裂伸长率、应力松弛率和加载卸载曲线下面积比。【结果】1.细胞相容性:三组脱细胞瓣膜支架种植内皮样细胞并培养7天后,HE染色和电镜观察可见细胞单层排列于支架表面,贴附生长,MTT法描绘生长曲线提示第3-6天为对数增长期。不同瓣膜支架细胞生长无明显差异。2.生物力学特性:三组脱细胞瓣膜支架与新鲜瓣膜比较,厚度、热皱缩温度有所增加,差异无统计学意义;瓣叶含水量增高,差异有统计学意义;断裂强度有所下降,断裂伸长率和AR比值略增加,差异无统计学意义。【结论】1.种子细胞在三种脱细胞猪主动脉瓣膜支架上贴附生长良好,2.三种瓣膜支架理化性质和机械性能（抗拉伸能力、变形恢复能力和顺应性）稳定;3.经Triton X-100联合胰蛋白酶脱细胞处理的瓣膜支架是三组中理想的组织工程用支架。第四部分:分层种植方式体外构建组织工程化心脏瓣膜的实验研究【目的】本实验通过以脱细胞猪主动脉瓣为支架,分层种植由成人骨髓间充质干细胞诱导分化的内皮样细胞和成纤维样细胞,研究构建具有分层结构的初级组织工程化心脏瓣膜,为以后的动态培养和移植实验奠定基础。【方法】取Triton X-100联合胰酶法脱细胞处理的猪主动脉瓣叶,制成1cm×0.5cm大小的支架片,并用纤维连接蛋白预处理。Brdu标记成纤维样细胞并在ECMgel凝胶中混悬,然后种植于经过预处理的瓣叶,静置培养24小时;DAPI标记内皮样细胞,接种于种植有成纤维样细胞-ECMgel的支架表面,静置培养7天。标本行HE染色和电镜扫描观察组织学结构,荧光显微镜观察种子细胞分布。【结果】Brdu标记的成纤维样细胞呈现明亮的黄绿色荧光,DAPI标记的内皮样细胞呈蓝色。ECMgel混悬成纤维样细胞后凝胶化,半透明,成纤维样细胞呈星状排列分布于凝胶中的不同层次。构建的组织工程化心脏瓣膜,HE染色下可见三层结构:内皮样细胞层、成纤维样细胞—ECMgel凝胶层、脱细胞支架层。扫描电镜下可见内皮样细胞在支架材料表面贴附良好,细胞排列较紊乱,部分细胞已开始融合。直接荧光显微镜下可见支架材料表面铺满被DAPI标记的的内皮样细胞,呈蓝色;免疫荧光染色瓣膜横断面可见内皮下层内散在分布Brdu标记的成纤维样细胞,呈明亮的黄绿色荧光【结论】1.ECMgel是携带成纤维样细胞良好的基质;2.利用分层种植和复合培养的方法,可以构建与正常瓣膜组织结构相似的组织工程化心脏瓣膜。