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目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病,是由于胰岛素分泌和/或作用缺陷所引起。随着糖尿病发病率的逐年上升,其并发的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)也日益受到人们重视。糖尿病心肌病是糖尿病常见的心血管并发症,是糖尿病患者心力衰竭及猝死的首要原因,其典型临床症状是心脏增大、心律失常,较易发生充血性心力衰竭,而其发病机制目前尚不完全清楚。Corin是一种主要在心脏表达的丝氨酸蛋白酶,能够高度特异的将心房钠尿肽原(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)转化为有活性的心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)。ANP是一种可以促进肾脏排钠、排水和舒张血管平滑肌的多肽类激素,主要在心房肌细胞中合成,其与心力衰竭和高血压的发生发展密切相关。研究发现,Corin基因缺失或表达减少与重大心血管疾病如心力衰竭、心肌肥厚及高血压等的发病密切相关。但心脏酶Corin介导的pro-ANP活化途径在糖尿病心肌病中是否发挥作用,目前尚不清楚。因此,本课题采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建的糖尿病心肌病SD大鼠动物模型、高糖诱导的乳鼠原代心肌细胞及高糖诱导的H9c2心肌细胞株,从整体、细胞、分子等不同层面,通过体内、体外实验研究,探讨Corin介导的pro-ANP活化途径与糖尿病心肌病之间的关系。方法1.一次性腹腔注射STZ构建糖尿病SD大鼠动物模型;2.超声心动图、血流动力学及大鼠心脏重量与体重的比值(心重/体重,HW/BW)检测,以鉴定糖尿病心肌病SD大鼠动物模型;3.透射电子显微镜观察大鼠心肌细胞超微结构的改变;4.RT-PCR和Real-Time PCR检测Corin及ANP m RNA在DCM大鼠心肌组织中的表达;5.Western Blot和免疫组织化学检测Corin及ANP蛋白在DCM大鼠心肌组织中的表达;6.Western Blot检测Corin及ANP在注射STZ后第12、16、20和33周的DCM大鼠心肌组织中的表达;7.ELISA检测DCM大鼠血浆中N末端心房钠尿肽原(N-terminal pro-atrial natriuretic peptide,NT-pro ANP)的浓度;8.Real-Time PCR检测Corin和ANP m RNA在高糖诱导的乳鼠原代心肌细胞中的表达;9.Western Blot和细胞免疫荧光染色检测Corin和ANP蛋白在高糖诱导的乳鼠原代心肌细胞中的表达;10.Western Blot检测Corin和ANP蛋白在高糖诱导36 h、48 h和60 h的乳鼠原代心肌细胞中的表达;11.Western Blot检测Corin和ANP蛋白在高糖诱导36 h、48 h和60 h的H9c2心肌细胞株中的表达。结果1.成功构建糖尿病SD大鼠动物模型:STZ注射一周后,DCM组大鼠随机血糖水平大于16.7 mmol/L,尿糖阳性,且出现多饮、多食、多尿现象。与Ctrl组大鼠相比,DCM组大鼠随机血糖水平明显升高(P<0.01),体重明显降低(P<0.01)。2.成功构建糖尿病心肌病SD大鼠动物模型:超声心动图检查显示,与Ctrl组大鼠相比,DCM组大鼠IVSd、LVPWd与LVIDd均减弱(P<0.05),LVIDs明显升高(P<0.01),FS%与EF%均明显降低(P<0.01);血流动力学检查结果显示,DCM组大鼠+dp/dt与-dp/dt明显低于Ctrl组(P<0.01),MABP无明显差异(P>0.05);DCM组HW/BW值明显高于Ctrl组(P<0.01);3.在透射电子显微镜下观察发现,Ctrl组大鼠心肌组织肌纤维排列规则,心肌细胞形态正常,超微结构完整,线粒体包膜完整,线粒体嵴分布均匀;而DCM组大鼠心肌组织肌纤维排列紊乱,心肌细胞形态异常,超微结构改变明显,线粒体包膜轮廓不清,亦可见线粒体包膜破损,线粒体嵴分布不均,线粒体嵴间距增大,甚至可见线粒体破溃死亡,可见较多糖原沉积;4.大鼠心肌组织RT-PCR及Real-Time PCR结果显示,DCM组Corin和ANP m RNA表达水平均明显低于Ctrl组(P<0.05);5.大鼠心肌组织Western Blot及免疫组织化学结果显示,DCM组Corin和ANP蛋白表达水平均明显低于Ctrl组(P<0.05);6.大鼠心肌组织Western Blot结果显示,随着DCM大鼠周龄的增加,Corin和ANP蛋白表达水平逐渐降低;7.大鼠血浆ELISA结果显示,DCM组血浆NT-pro ANP浓度明显低于Ctrl组(P<0.01);8.乳鼠原代心肌细胞Real-Time PCR结果显示,高糖(high glucose,HG)组诱导的乳鼠原代心肌细胞中Corin和ANP m RNA表达水平明显低于正常对照(normal glucose,Ctrl)组(P<0.01);9.乳鼠原代心肌细胞Western Blot及细胞免疫荧光染色结果显示,HG组Corin和ANP蛋白表达水平均明显低于Ctrl组(P<0.05);10.乳鼠原代心肌细胞Western Blot结果显示,随着高糖环境诱导时间的延长,Corin和ANP蛋白表达水平逐渐降低;11.H9c2心肌细胞株Western Blot结果显示,随着高糖环境诱导时间的延长,Corin和ANP蛋白表达水平逐渐降低。结论1.成功构建糖尿病SD大鼠动物模型;2.成功构建糖尿病心肌病SD大鼠动物模型;3.在糖尿病心肌病中,Corin及ANP m RNA表达水平下降;4.在糖尿病心肌病中,Corin及ANP蛋白表达水平下降;5.Corin介导的pro-ANP活化途径参与到糖尿病心肌病发病过程中,并与糖尿病心肌病病程密切相关。