论文部分内容阅读
本实验通过制备沙丁胺醇(Sal)人工免疫抗原，免疫Balb/c小鼠获得了高效价、高灵敏度的抗体血清；进一步将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，制得杂交瘤细胞，通过HAT培养基筛选，获得二株阳性杂交瘤细胞；并对二株细胞腹水单克隆抗体的特性进行鉴定，均具有较强的特异性，本实验利用酶联免疫亲和技术为检测动物食品中沙丁胺醇的残留提供可靠的技术手段，通过标准曲线的优化和样品检测方法的调试制备SAL检测试剂盒。主要的研究内容及结果如下：
1、沙丁胺醇(Sal)人工抗原的合成。采用混合酸酐法和活泼酯法两种方法将Sal与BSA和OVA进行偶联，制备人工免疫抗原BSA-Su-Sal和包被抗原OVA-Su-Sal。通过TLC、紫外扫描、ELISA检测等方法确证小分子Sal成功与大分子物质BSA偶联得到BSA-Su-Sal偶联物，产物中Sal与BSA的摩尔比最大为20:1。
2、免疫小鼠得到高效价血清并优化了细胞培养条件。免疫抗原小鼠皮下多点免疫，常规ELISA检测效价，小鼠免疫效果良好，最高效价可达320000，利用ELISA棋盘法检测高效价血清抗体，确定细胞检测时包被抗原的包被浓度。通过对不同批次胎牛血清、不同来源SP2/0细胞比较选择，优化了细胞培养条件，使融合前细胞状态透明均匀并且饱满，融合后未融合细胞较快被吞噬，融合成功的细胞集中且活跃。结果表明，胎牛血清、杂交瘤细胞SP2/0、PEG(080802)、融合时间控制等条件的合理化能够得到较好的融合效果。
3、经过融合克隆等步骤，成功制备Sal单克隆抗体，得到稳定的细胞株。利用优化的细胞培养条件进行融合细胞的培养，随时观察并确定细胞生长情况，根据棋盘确定的最佳包被浓度包被板条，检测细胞并筛选出能稳定分泌抗Sal抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2C8D5A9、5E7B3H3，并对其的特性作了初步鉴定，制备小鼠腹水细胞，得到上清单抗，并适时冻存细胞株。
4、利用抗体与抗原特异性结合制备沙丁胺醇ELISA试剂盒。制备特征性标准曲线，摸索尿样样品处理方式，调节样品稀释液pH值和离子强度，以排除样品检测中的假阳性干扰，检测试剂盒板条批间批内差，完善试剂盒制备流程，以期得到高灵敏度、高稳定性的试剂盒。