研究背景:大量研究证实,心率增快是多种心血管疾病的独立危险因素。严格的心率管理显著改善冠心病和慢性心力衰竭患者的生存率。窦性心动过速普遍存在于病毒性心肌炎的患者。心肌炎最常用的治疗手段是“休息”,其与“减慢心率”在某种程度上有异曲同工之妙。伊伐布雷定是一种单纯减慢心率的药物,仅选择性地作用于窦房结I（f）电流,对心脏收缩功能没有不利影响。目前已证实,其在心衰中具有降低心脏致炎因子和抑制心肌纤维化的作用。我们课题组前期研究发现,伊伐布雷定在急性病毒性心肌炎小鼠模型中具有减轻心肌炎症损伤的作用。然而,伊伐布雷定在慢性病毒性心肌炎中的作用,特别是延缓病毒性心肌炎向扩张型心肌病转化的作用,目前尚无研究报导。因此,本研究以柯萨奇病毒B3（CVB3 Nancy）嗜心肌株多次诱导的慢性心肌炎小鼠为研究对象,采用伊伐布雷定单纯减慢慢性病毒性心肌炎小鼠的心率,观察慢性病毒性心肌炎小鼠心肌的重构、纤维化、凋亡、炎症因子及MAPK信号通路相关蛋白的变化,明确伊伐布雷定在延缓病毒性心肌炎演变成扩张型心肌病中的作用及机制。第一部分伊伐布雷定对延缓慢性病毒性心肌炎向扩张型心肌病演变的作用研究目的:探讨伊伐布雷定在病毒性心肌炎向扩张型心肌病演变中的作用;研究方法:150只雄性4-6周龄Balb/c小鼠,随机分为3组:35天空白对照组（CON-35,n=10）,65天空白对照组（CON-65,n=10）,慢性病毒性心肌炎组（CVMC,n=130）。在第1、14、28天时分别通过腹腔接种100TCID₅₀的CVB3病毒液0.2 ml、0.25 ml、0.3 ml共三次,来建立CVMC模型。正常空白对照组腹腔注射同等剂量Eagle’s培养液。首次接种病毒液当天定义为第1天。饲养至第35天后,在CVMC组随机抽取7只存活小鼠（CVMC-35,n=7）,与35天空白对照组小鼠（CON-35）的心脏功能、心肌组织病毒滴度、炎症因子以及纤维化程度等进行比较。然后将剩下的存活的CVMC小鼠再随机分为2组:伊伐布雷定治疗组（IVA）和未治疗组（Untreated CVMC-65）。从第35天开始,IVA治疗组小鼠每天灌胃给药伊伐布雷定(10 mg·kg^-1·d^-1)水溶液,未治疗CVMC-65组小鼠灌胃同等剂量生理盐水,两组均连续给药30天,至第65天。观察各组不同处理条件下Balb/c小鼠的一般生长情况、生存率,采用动物心超评价IVA治疗组和未治疗组小鼠心功能情况。于病毒感染后第65天,从治疗组、未治疗组和空白对照组中各随机抽取7只小鼠处死,制作小鼠心肌病理切片,Masson染色观察心肌纤维化损伤程度,蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测各组小鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6及胶原蛋白（Collagen,COL）表达水平,及WB检测各组小鼠心肌组织p38MAPK通路蛋白的表达水平。研究结果:1)小鼠一般情况:CVMC组小鼠精神状态不佳,厌食,体重减轻,毛发粗糙无光泽,死亡率明显高于正常空白对照组。正常对照组小鼠精神佳,活动耐力强,进食量大,体重稳步增长,毛色均匀光亮顺滑。2)生存率:35天空白对照组及65天空白对照组均未见小鼠死亡,生存率均为100%。CVMC组小鼠35天的生存率为47.65%（62/130）。从第35天至65天,伊伐布雷定治疗的CVMC小鼠的生存率80%（16/20）,显著高于未处理组小鼠的生存率48.57%（17/35）。3)胶原蛋白表达差异:Masson染色显示,与空白对照组相比,CVMC组小鼠心肌细胞间质纤维化明显加重（P（27）0.05）,伊伐布雷定能显著减少心肌组织的纤维化程度,差异有统计学意义（P（27）0.05）。WB分析发现,第35天和第65天的CVMC小鼠的胶原蛋白collagen I、collagen III的表达均明显较正常对照组上调,第65天的CVMC小鼠的胶原蛋白collagen I、collagen III的表达较第35天的明显增加,而伊伐布雷定能显著减少心肌组织胶原蛋白水平（P（27）0.05）,改善心肌纤维化。4)心脏结构与功能:正常对照组小鼠的心腔大小,左心室壁及室间隔厚度均正常。第35天CVMC小鼠较正常对照组小鼠心室率增加,心腔扩大,心室壁明显变薄,LVEF明显降低（P（27）0.001）。至病毒感染后第65天时,未处理组小鼠较第35天心超测得的参数均进一步恶化（P（27）0.001）。伊伐布雷定显著减慢CVMC小鼠的心室率,显著延缓心腔扩大,显著增加心室壁厚度,显著升高LVEF及FS,与未处理组比较有统计学差异（P（27）0.05）。5)IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白水平:与正常对照组比较,CVMC组在第35天和第65天,炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达均明显上调（P（27）0.05）。与未处理的感染组相比,伊伐布雷定能显著减少相关炎症因子的表达（P（27）0.001）。6)p38MAPK通路蛋白表达水平:与第35天CVMC组以及与第65天未处理CVMC组比较,伊伐布雷定治疗组小鼠心肌组织p-p38MAPK的表达水平显著下调,差异有统计学意义（P（27）0.05）。研究结论:伊伐布雷定能延缓慢性病毒性心肌炎向扩张型心肌病演变。伊伐布雷定显著减慢慢性病毒性心肌炎小鼠的心率,显著下调心肌组织炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,抑制p38MAPK信号通路蛋白的表达,抑制心肌胶原蛋白合成,改善心肌间质纤维化,逆转心室重塑,使心腔缩小,心室壁及室间隔厚度增加,从而改善心功能,阻止病毒性心肌炎演变成扩张型心肌病,提高心肌炎小鼠的生存率。第二部分伊伐布雷定对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响研究目的:探讨伊伐布雷定对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的作用。研究方法:将90只雄性Balb/c小鼠随机分为6组:42天正常对照组（组1,n=10）,慢性病毒性心肌炎（CVMC）1组（组2,n=20）,72天正常对照组（组3,n=10）,正常+伊伐布雷定（IVA）组（组4,n=10）,CVMC+IVA组（组5,n=20）,CVMC2组（组6,n=20）。在第1、14、28天时组2、5、6分别通过腹腔接种CVB3病毒液0.2 ml、0.25 ml、0.3 ml共三次,来建立CVMC模型,组1、3、4于腹腔注射等量的Eagle’s培养液。首次接种病毒液当天定义为第1天。第42天时组1与组2行心脏超声检查后处死小鼠,取出心脏组织用4%多聚甲醛固定后做HE染色。组4、5从第42天起给予IVA(10 mg·kg^-1·d^-1)灌胃治疗,组3、6予生理盐水灌胃(10 mg·kg^-1·d^-1),连续治疗30天,至第72天。第72天时组3、4、5、6行心电图、心脏超声检查后处死小鼠取出心肌组织,半数用4%多聚甲醛固定后HE染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡,半数冻存于-80℃冰箱,采用WB检测Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达情况。研究结果:1)第42天时,组1和组2心超结果显示组2左心室内径较组1扩大,LVEF和LVFS明显降低（P<0.05）。HE染色结果显示组2左心室心腔明显扩大,心肌间质大量成纤维细胞浸润。2)第72天时,心电图结果显示组6小鼠的心率与组3相比,明显增快（P<0.05）,经IVA治疗一月后,组4小鼠心率较组3明显下降,组5较组6也明显下降,但组4、5间无明显差异。3)第72天时的心脏超声结果显示组6小鼠较组3的左心室内径扩大（P<0.05）,LVEF及LVFS明显降低（P<0.05）;经IVA治疗后组5小鼠左心室内径与组6相比明显缩小,LVEF及LVFS明显改善（P<0.05）;虽然IVA能够降低正常小鼠心率,但组3、4之间心功能无明显差异。4)HE染色显示组3、4之间无明显差异,组6较组3左心室内径明显扩大,心肌间质成纤维细胞明显增多;组5较组6的心腔缩小,心肌间质成纤维细胞也减少,但仍较组3的心腔扩大,心肌间质成纤维细胞也增多。5)TUNEL检测发现组6凋亡心肌细胞明显高于组3,经IVA治疗后组5小鼠凋亡的心肌细胞明显减少（P<0.05）,但仍明显高于组3。6)WB结果显示组6的Bax及Caspase-3明显高于组3,IVA治疗后组5的这两种蛋白表达量均低于组6（P<0.05）;Bcl-2在组3、4中高表达,在组6中低表达,IVA治疗组组5表达量明显高于组6（P<0.05）。而三种蛋白在组3、4间的表达均无显著差异。研究结论:伊伐布雷定显著降低正常和CVMC小鼠心率,显著改善CVMC小鼠心功能并逆转心室重构。伊伐布雷定可能通过上调CVMC小鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达水平,进而减少Caspase-3的表达来抑制心肌细胞凋亡。