风疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,是最常见、最重要的TORCH综合征病原体之一。风疹通常是一种轻度的儿童疾病。RV感染的危害主要在于先天性感染,孕妇在妊娠期,特别是妊娠前3个月感染RV,可引起胎儿宫内感染,产生先天性风疹综合征,造成婴儿全身多种器官发育畸形或功能异常,如白内障、耳聋、先天性心脏病等,严重时可出现死胎或流产。风疹的治疗至今尚无特效疗法,一些抗病毒药物临床治疗效果不佳,不能改变病程和预后,更难以预防CRS。进行疫苗接种是目前预防风疹和CRS最有效的手段。目前临床应用的疫苗均为减毒活疫苗,其中的RV可能通过胎盘感染胎儿,仍有致畸的危险性。Hofmann等证实风疹疫苗病毒可通过胎盘与持久的胎儿感染有关,故妊娠早期的妇女无法使用该疫苗预防风疹感染,而且成年妇女接种尤其是产后接种后可发生一过性关节炎(10%)和关节痛(2.5%)。亚单位疫苗不含病毒核酸,只含病毒的蛋白质,故其免疫原性仍然保留,且非常安全,可供孕妇使用,但亚单位疫苗免疫效果差,不持久,需要反复注射,不易推广使用。若能改变RV的基因组,从而改变它的表达产物和生物学活性,就可以消除或降低RV的致畸性;也可以通过改变其侵入细胞或复制的特性来消除或减少胎儿感染的危险性。细胞融合是包括RV在内的许多有膜病毒侵入细胞、复制、释放、传播、致病的重要生物过程,也是细胞间信息传递的重要步骤。有膜病毒与靶细胞膜融合后可能造成两种后果:一是病毒的核心蛋白和遗传物质进入宿主细胞复制,并随宿主细胞的分裂传至子代细胞,造成宿主细胞死亡,健康细胞受到侵染;二是破坏靶细胞膜的稳定性,使细胞内外环境失去平衡,最终导致细胞病变或死亡。因此,若能明确RV引起细胞融合的分子机制,尤其是包膜糖蛋白细胞融合活性位点和非活性位点的精确定位,可以为研制更安全有效的RV新型基因工程疫苗(基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等)和特异性抗病毒的多肽类药物、预防和治疗RV感染奠定理论基础和提供技术参数,还有助于RV致畸机制的研究,对包膜病毒细胞融合的分子机制的研究也有广泛的意义。RV 3′端结构基因编码的三种结构蛋白中,衣壳蛋白C与基因组RNA结合形成核衣壳,包膜糖蛋白E2和E1是I型包膜糖蛋白,组成异二聚体而在病毒表面形成刺突结构,行使主要生物学功能。其中E2包膜糖蛋白上含有3个或4个糖基化位点,本研究中的RV JR23株E2包膜糖蛋白上含有3个Asn-X-Ser结构的糖基化位点,分别位于N53、N71与N129;E1包膜糖蛋白上含有3个Asn-X-Thr结构的糖基化位点,分别位于N76、N177与N209。N-联糖基化作用是真核细胞表达系统中一个重要的蛋白翻译后修饰过程,这种糖基化修饰在形成和维持具有生物学活性的糖基化蛋白构象、保护蛋白多肽免受细胞内蛋白水解酶的作用与影响蛋白的抗原性和免疫原性中具有重要的作用。为研究RV包膜糖蛋白糖基化作用对特异性细胞融合的影响,我们构建了一系列突变体以分别去除特定位点的糖基化作用,观察突变前后其引起的特异性细胞融合功能的变化,结果发现某些位点糖基化作用的去除,会明显降低特异性细胞融合活性。说明这些糖基化位点的糖基化作用通过形成和维持蛋白的正确构象以保证蛋白向细胞表面的转运,参与了细胞融合过程。但任何一个糖基化位点的突变,都不能完全阻止其引起的细胞融合,而3个或3个糖基化位点联合突变时,由于联合突变体在细胞表面的表达效率显著降低导致其细胞融合活性消失。说明包膜糖蛋白的不同糖基化位点的糖基化在特异性细胞融合中联合起作用,也可能与其它因素在特异性细胞融合中共同起作用。为寻找E2和E1包膜糖蛋白的细胞融合活性区域,我们选择两种蛋白中的特定氨基酸进行定点突变。而20种氨基酸中,亮氨酸的疏水性较强,在蛋白结构的形成和维持中具有重要的作用,故在E2与E1包膜糖蛋白中行使主要生物学功能的胞外区域,分别选择保守性的亮氨酸位点进行突变,观察突变前后其引起特异性细胞融合功能的变化,以初步探讨其引起细胞融合的分子机制。一、RV包膜糖蛋白糖基化作用对细胞融合的影响本研究采用体内同源重组的方法,构建六个突变体,每个突变体改变一个相应的糖基化位点以阻断该位点的糖基化作用。其中突变体N53G、S73I和S131V分别去除了E2包膜糖蛋白第53位、71位或129位的天冬酰胺的糖基化作用,T78A、T179A和T211A则分别去除了E1包膜糖蛋白第76位、177位或209位天冬酰胺的糖基化作用。FACS分析表明,除S131V之外,其它突变体蛋白在细胞表面的表达效率均有不同程度的降低。含有不同突变位点的重组质粒转染细胞后,均出现不同程度的细胞融合。通过除以相应蛋白在细胞表面的表达率对其细胞融合率进行了校正。与野毒株相比,校正后突变体N53G、S73I、S131V、T78A、T179A与T211A的细胞融合率分别为62.73%、66.66%、55.12%、66.93%、87.33%与90.18%。这说明E2蛋白的3个糖基化位点与E1蛋白的糖基化位点N76在RV引起的细胞融合中具有重要的作用,而E1蛋白的糖基化位点N177与N209对RV引起的细胞融合影响较小。含有不同突变位点的重组质粒转染细胞后,均可出现血吸附,与野毒株比较,除S73I与T78A突变体蛋白的血吸附效率略有降低之外,其它突变体蛋白的血吸附效率保持不变。本研究中还构建了一系列糖基化位点的联合突变体,分别为N53G-S73I、N53G-S131V、S73I-S131V、N53G-S73I-S131V、T78A-T179A、T78A-T211A、T179A-T211A、T78A-T179A-T211A、N53G-T78A、N53G-T179A与N53G-T211A。FACS检测发现,与野毒株相比,除N53G-T78A(25.30%)与N53G-T211A(21.91%)之外,其它联合突变体在细胞表面的表达效率均低于20%。Giemsa染色在所有联合突变体转染的细胞中均检测不到细胞融合。而血吸附实验结果发现,除N53G-S131V、N53G-T78A与N53G-T211A转染细胞后能吸附少量的鸽红细胞外,其它联合突变体中均检测不到血吸附。二、E2包膜糖蛋白亮氨酸突变对特异性细胞融合的影响采用体内同源重组的方法,分别得到突变体E2 L14A、L35A、L58A、L105A、L128A、L144A、L178A、L183A、L225A。其中L14、L58、L128、L178、L225位于E2蛋白的coil结构中,L35、L105、L144、L183位于E2蛋白的strand结构中。FACS分析表明,与野毒株相比,除L144A与L225A之外,其它突变体蛋白在细胞表面的表达效率均有不同程度的降低。含有不同突变位点的重组质粒转染细胞后,均出现不同程度的细胞融合。通过除以相应蛋白在细胞表面的表达率对其细胞融合率进行了校正。与野毒株相比,突变体L14A、L35A、L58A、L105A、L128A、L144A、L178A、L183A与L225A的细胞融合率分别为88.31%、79.55%、41.79%、49.16%、54.34%、49.56%、72.31%、82.09%与69.09%。即各突变体蛋白引起特异性细胞融合的效率均有不同程度的降低。含有不同突变位点的重组质粒转染细胞后,均可出现血吸附,与野毒株比较,L58A、L105A、L128A与L144A突变体蛋白的血吸附效率有所降低,其它突变体蛋白的血吸附效率不变。三、E1包膜糖蛋白亮氨酸突变对特异性细胞融合的影响采用体内同源重组的方法,分别构建突变体E1 L23A、L62A、L98A、L169A、L192A、L255A、L265A、L322A、L334A、L370A与L391A。其中L62、L265、L322、L334、L391位于E1蛋白的coil结构中,L23、L98、L169、L192、L255、L370位于E1蛋白的strand结构中。突变时分别将相应的亮氨酸突变为丙氨酸。FACS分析表明,与野毒株相比,除L192A、L334A、L370A与L391A之外,其它突变体蛋白在细胞表面的表达效率均有不同程度的降低。值得注意的是,L370A突变体蛋白在细胞表面的表达效率略高于野毒株在细胞表面的表达效率。含有不同突变位点的重组质粒转染细胞后,均出现不同程度的细胞融合。通过除以相应蛋白在细胞表面的表达率对其细胞融合率进行了校正。与野毒株相比,突变体L23A、L62A、L98A、L169A、L192A、L255A、L265A、L322A、L334A、L370A与L391A的细胞融合率分别为60.89%、73.28%、86.41%、84.21%、91.62%、87.00%、48.96%、74.88%、93.38%、80.25%与73.64%。即各突变体蛋白引起特异性细胞融合的效率均有不同程度的降低。含有不同突变位点的重组质粒转染细胞后,均可出现血吸附,与野毒株比较,除L98A、L169A与L391A外,其他突变体蛋白的血吸附效率均有不同程度的降低。从本实验结果可得出的结论:E2蛋白的3个糖基化位点和E1蛋白的N76在RV引起的细胞融合中均有重要作用,其中S73I与T78A对敏感细胞的吸附能力略有降低,这也是其影响细胞融合的原因之一。同一个糖基化位点的糖基化作用在蛋白的转运表达与其引起的细胞融合中具有不同的重要性,其中E2蛋白的N71与E1蛋白的N177对其在细胞表面的表达具有更重要的作用。2个或3个糖基化位点同时突变时,由于其在细胞表面表达效率显著降低而使细胞融合现象消失。E2蛋白二级结构中的coil结构对蛋白向细胞表面的转运及在细胞表面的正确表达有重要的作用。而在E2蛋白中行使主要生物学功能的胞外区部分,其氨基酸序列中间靠近氨基端的蛋白区域(L58～L144)对引起的特异性细胞融合具有重要的作用。E1包膜糖蛋白各突变体引起的细胞表面表达效率的变化和细胞融合效率的变化具有一定的一致性,说明这些亮氨酸的突变同时影响到蛋白在细胞表面的表达和引起细胞融合的功能,影响的程度则取决于亮氨酸在E1蛋白中所处的位置。其氨基端的蛋白区域和氨基酸序列中间靠近羧基端部分(L265及附近)的蛋白区域对引起的特异性细胞融合具有重要作用。