论文部分内容阅读
目的:甘氨酸受体(Glycine receptors;GlyRs)是由α(α1-α4)亚基和β亚基组成的五聚体蛋白。在成年动物的脊髓背角中,含有α1亚基的甘氨酸受体介导大多数抑制性甘氨酸能突触传递。外周组织或神经损伤能够减弱甘氨酸能抑制,诱发痛觉敏化。HUWE1(HECT,UBA,WWE domain containing 1)是一种E3泛素连接酶,可以对多种蛋白进行泛素化修饰。已有研究表明:HUWE1可能调节免疫细胞的功能,但在神经突触中,HUWE1的作用还不清楚。本研究旨在探讨HUWE1对甘氨酸受体的影响;探讨炎性损伤诱发的甘氨酸能去抑制与HUWE1之间的关系。方法:本研究在体外培养的脊髓神经元上,通过免疫细胞化学染色方法,研究HUWE1在脊髓神经元中的分布及其对甘氨酸受体胞内运输(intracellular trafficking)的影响;通过免疫共沉淀方法,探讨HUWE1与甘氨酸受体之间的相互作用、以及HUWE1对甘氨酸受体的泛素化的影响。通过膜片钳电生理实验方法,研究外周炎性损伤对甘氨酸能突触传递的影响和HUWE1对炎性小鼠甘氨酸能突触传递的影响;通过行为学方法,测试小鼠的机械性缩足阈值(PWTs)和热缩足潜伏期值(PWLs),探讨HUWE1对完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant;CFA)诱发的痛觉过敏和痛觉超敏的影响。结果:(1)HUWE1分布在脊髓神经元的兴奋性突触和抑制性突触之中;(2)HUWE1特异性结合甘氨酸受体的α1亚基,但却不能结合甘氨酸受体α3亚基、NMDA受体GluN1亚基、AMPA受体GluA1亚基以及GABA_A受体β2亚基和β3亚基;(3)神经活动(neural activity)通过增加HUWE1在抑制性突触中的分布,提高HUWE1与α1的相互作用;(4)HUWE1以活动依赖性的方式,泛素化修饰α1亚基;(5)HUWE1介导的泛素化,促进α1的内陷,降低α1在细胞膜表面的表达;(6)外周炎性损伤促进HUWE1与α1的结合,增强HUWE1对α1的泛素化修饰,减弱甘氨酸能突触传递;(7)shRNA干扰HUWE1的表达,增强炎性疼痛动物脊髓背角的甘氨酸能突触传递;(8)shRNA干扰HUWE1的表达,能够有效抑制炎性痛觉过敏和痛觉超敏。结论:HUWE1对甘氨酸受体α1亚基的泛素化修饰,抑制甘氨酸能突触传递;降低HUWE1的泛素化能力,能够缓解病理性疼痛症状。