第一部分Notchl/D114、VEGF/VEGFR、Ang/Tie2通路对AML发生发展及预后影响的研究研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一组高度异质性疾病,其发生发展是一个多基因改变和多步骤的过程。目前细胞遗传学异常已经成为AML患者最常用的临床预后因素,但传统细胞遗传学存在缺陷,分子遗传学的改变对预后的意义日趋重要。血管生成是指在已有血管床上发展而形成新的血管,在肿瘤的生长和转移中起重要作用。骨髓微环境内血管生成对AML疾病进展、耐药及预后有重要意义。近年来研究显示,Notch/D114言号通路、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)通路及其受体、促血管生成素(angiopoietin, Ang)及其受体Tie2参与多种实体瘤的发生发展,也是影响血管生成的关键因素。我们之前检测发现AML患者外周血存在Notch1/D114及VEGF通路的异常表达,但AML患者骨髓单个核细胞Notch1/D114、VEGF/VEGFR表达情况,Ang/Tie2通路在调节AML血管生成中的作用及其与Notch1/D114、 VEGF/VEGFR的相互关系,Notch1/D114、VEGF/VEGFR、Ang/Tie2通路对AML的预后影响均尚不清楚,有待于进一步研究。目的：研究AML患者骨髓单个核细胞血管生成相关通路Notch1/D114、 VEGF/VEGFR、Ang/Tie2的表达及相互关系,探讨血管生成相关基因及临床特征对AML预后的影响,为AML的发生发展及个体化分层治疗提供新的实验室依据。方法：1.研究对象：选取60例初诊AML患者,分别根据年龄、性别、FAB分型、染色体核型等进行分组,全面采集临床资料,中位随访时间为25个月,以40例健康志愿者为对照组。2.标本采集：收集AML患者组与对照组骨髓标本,采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞。3. Real-time RT-PCR检测血管生成相关基因表达：应用Trizol方法提取细胞总RNA, M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,采用real-time RT-PCR检测血管生成相关基因Notch1、D114、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、Ang-1、 Ang-2、Tie2的mRNA表达水平,同时以GAPDH为内参。4. Western blot检测Notch1、D114蛋白表达：应用裂解液裂解细胞总蛋白,SDS-PAGE进行凝胶电泳,Western blot法检测Notch1、D114蛋白表达水平。5.统计分析：应用SPSS13.0软件进行数据处理,Mann-Whitney U检验,方差分析(Analysis of variance, ANOVA)或Kruskal-Wallis检验分析患者组与对照组、不同临床特征各亚组患者之间血管生成相关基因mRNA表达水平的差异;Spearman’s秩相关分析各基因之间及其与临床特征的相关性Kaplan-Meier法绘制AML患者生存曲线,log-rank检验比较不同组别患者生存差异；单因素Cox比例风险回归分析可能的预后因素,将单因素回归分析中有意义的自变量引入多因素Cox回归模型分析独立预后因素,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1. Real-time PT-PCR检测发现初诊AML患者骨髓单个核细胞Notch1、D114、 VEGF、VEGFR-2、Ang-2的mRNA表达水平显著高于对照组(P均<0.05),但VEGFR-1、Ang-1、Tie2农达与对照组比较,差异无统计学意义(P均>0.05)。2. Western blot检测发现初诊AML患者骨髓单个核细胞Notch1与D114蛋白表达水平较对照组明显升高(P<0.001)。3.患者组中位VEGFR-2/VEGFR-1比值是对照组的3.61倍,两组比较差异有统计学意义(P=0.04),Ang-2/Ang-1比值较对照组亦显著升高(P=0.015)。4.初诊AML患者Notch1与D114表达呈正相关(r=0.326,P=0.013),VEGF与VEGFR-2呈正相关(r=0.354,P=0.007),Ang-1与Tie2呈正相关(r=0.463,P=0.001),D114与VEGF呈正相关(r=0.663,P=0.001),Notch1与Ang-2呈正相关(r=0.324,P=0.012)。5.血管生成相关基因与患者临床特征的相关性不同性别及FAB分型亚组各血管生成基因表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。45岁以下患者组Tie2表达水平高于年龄大于45岁者(P=0.03),染色体核型各亚组间D114及VEGF表达差异有统计学意义(P=0.001)。初诊时骨髓原始细胞比例分别与Notch1(r=0.428,P=0.001)、D114(r=0.288, P=0.026)、VEGF(r=0.428, P=0.001)、 Ang-2(r=0.474, P<0.001)呈正相关。6.单因素分析发现不良核型及Notch1、D114、VEGF、Ang-2高表达AML患者总生存期(overall survival,OS)较短(P<0.05)；多因素Cox回归分析发现染色体核型及Notch1、D114、VEGF、Ang-2表达水平对总生存时间均有显著影响(P<0.05)。7. Kaplan-Meier生存曲线显示中危染色体异常AML患者若同时存在D114高表达,则其总生存期较短,但Notch1表达水平对其生存无影响。此外,低危及高危染色体异常AML患者Notch1、D114表达水平对OS无影响。8. VEGF及Ang-2高表达亚组AML患者Notch1对总生存时间有明显影响(P值均为0.001),VEGF高表达亚组患者D114表达越高,其生存期越短(P=0.001),D114表达水平对Ang-2高表达或低表达患者的总生存期均有明显影响(P=0.001)。结论：1.初诊AML患者存在血管生成相关通路Notch1/D114、VEGF/VEGFR、Ang/Tie2的异常表达,表现为Notch1、D114、VEGF、VEGFR-2、Ang-2的表达上调,Notch1/D114通路的异常活化,VEGFR-2/VEGFR-1及Ang-2/Ang-1比值的显著升高,提示Notch1/D114、VEGF/VEGFR、Ang/Tie2通路在AML发生发展中起一定作用。2.初诊AML患者Notch1/D114、VEGF/VEGFR、Ang/Tie2通路中部分因子之间存在相互关联,提示Notch1/D114、VEGF/VEGFR、Ang/Tie2在AM1骨髓微环境的新生血管形成中相互作用,且与年龄、染色体核型、骨髓原始细胞比例等临床特征有关。3.染色体核型及Notch1、D114、VEGF、Ang-2表达水平是影响AML预后的独立危险因素,进一步的研究发现D114高水平表达是中危染色体异常AML患者的不良预后因素,Notch1、D114在VEGF及Ang-2高农达患者中仍有预后意义,表明Notch1/D114通路的活化在AML预后中起较为重要的作用,以上研究有助于AML的预后判断,从而为AML的个体化分层治疗提供新的实验室依据。第二部分Notch通路在CML疾病进展及耐药机制中的作用研究研究背景：慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性肿瘤,该病具有特异性的Ph染色体或BCR/ABL融合基因。临床将CML分为慢性期(chronic phase, CP)、加速期(accelerated phase, AP)、急变期(blast crisis phase, BP)。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的出现使大多数患者的治疗大达到分子生物学缓解,但仍有部分患者产生耐药或疾病进展,细胞遗传学演变在此过程中起重要作用,其具体机制仍有待于深入研究。Notch通路在细胞增值、分化、凋亡中起关键作用,由Noteh受体、配体及细胞效应器组成。Notch1信号与肿瘤的关系最早发现于T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphocytic leukemia,T-ALL), t(7;9)(q34;q34.3)染色体易位使Notch1胞内区数量及活性持续增强,进而激活Hesl, HERP、RhoU等下游从因的转录,使T细胞分化受抑,最终导致白血病的发生。我们之前的研究显示Notch1表达下调能够增加T-ALL细胞对化疗药物的敏感性,提示Notch1异常激活对T-ALL耐药起一定作用。新近研究表明急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等恶性血液病均存在Notch1信号通路的异常表达,但目前Notch1通路相关基因在CML疾病进展及耐药中的作用国内外尚不明确,有待于进一步研究。目的：研究CML患者骨髓单个核细胞Notch1、Hes1的表达,探讨小干扰RNA(siRNA)介导的Notch1下调对K562/A02细胞药物敏感性的影响,为揭示CML疾病进展及其耐药机制提供新的实验室依据。方法：1.研究对象：选取77例CML患者,分为BP、AP、CP及完全缓解(complete remission, CR)四组患者,以16例健康志愿者为对照组。2.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测Notch1、Hes1mRNA表达情况：分离CML患者组与对照组骨髓单个核细胞,采用Trizol方法提取细胞总RNA,M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用real-time RT-PCR检测骨髓单个核细胞Notch1及Hes1mRNA表达水平。3.细胞培养：体外培养人髓系白血病细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02。4. Notch1siRNA片段的转染：将K562、K562/A02接种于24孔细胞培养板中,24小时后应用Lipofectamine2000将Notch1siRNA片段及空白对照siRNA分别转染两种细胞,72小时后应用real-time RT-PCR检测细胞转染前、后Notch1、Hesl mRNA的表达变化。5. Western blot检测Notch1蛋白表达变化：应用RIPA裂解细胞总蛋白,SDS-PAGE进行凝胶电泳,Western blot法检测siRNA转染K562、K562/A02细胞前、后Notch1蛋白表达水平。6.MTT法检测Notch1siRNA片段对细胞化疗药物敏感性的影响：取Notch1siRNA及空白对照siRNA片段转染的细胞按4×104个/孔接种于96孔细胞培养板中,24小时后加入不同浓度的阿霉素孵育48小时,MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。7.统计分析：应用SPSS17.0统计分析软件,采用Student t检验、Mann-Whitney秩和检验进行数据分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.CML患者Notch1mRNA表达水平急急变期CML患者Notch1表达显著高于对照组(118.4vs.14.1,P=0.002),慢性期CML患者Notch1表达与对照组比较,差异有统计学意义(68.3vs.14.1,P=0.014)。急变期患者Notch1水平高于慢性期患者,但两组比较差异无统计学意义(118.4vs.68.3,P=0.491)。2.CML患者Hesl mRNA表达水平慢性期CML患者Hesl表达显著高于对照组(201.5vs.58.2,P=0.0058)。急变期CML患者Hesl表达水平高于对照组及慢性期患者,但差异无统计学意义(285.9vs58.2,P=0.329；285.9vs201.5,P=0.275)。3. Notch1siRNA对K562、K562/A02细胞Notch通路基因表达的影响siRNA转染K562、K562/A02细胞72小时后,real-time RT-PCR检测发现干扰组Notch1与Hesl mRNA表达水平较对照组显著下降(P均<0.05),且Western blot结果亦显示干扰组Notch1蛋白表达水平较对照组明显下降。4. Notch1表达下调后K562、K562/A02细胞对药物敏感性的变化Notch1siRNA转染K562、K562/A02细胞后,加入不同浓度阿霉素作用48小时,MTT检测药物敏感性,将转染Notch1siRNA的两种细胞与转染空白对照者相比较,其阿霉素IC50值差异无统计学意义。结论：1.CML患者存在Notch1信号通路的异常表达,且疾病分期不同其表达水平各异,提示Notch1通路可能与CML的疾病进展有关。2.我们所应用小干扰RNA可有效下调K562、K562/A02细胞Notch1的表达。3.小干扰RNA介导的Notch1表达下调不能增加K562/A02细胞对阿霉素的药物敏感性,提示下调Notch1表达对逆转K562/A02细胞耐药无明显作用,仍需探讨其他耐药机制。第三部分microRNA分子在AML耐药中的作用及机制研究研究背景：急性髓系白血病(AML)是严重威胁人类健康的血液系统常见恶性疾患,现有治疗手段的提高虽使该病疗效有所改观,但仍有部分患者产生原发或继发耐药,探寻白血病耐药机制及其逆转对策已成为当前研究的重要问题。microRNA (miRNA)是一类长度序列高度保守的内源性非编码小RNA分子,miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学进程,并对肿瘤的发生、发展、耐药起重要作用。最近研究显示miRNA在白血病中有异常表达,可作为白血病分型诊断及预后判断的指标之一。但关于miRNA在AML发生发展及耐药中的作用尚不十分明确,有待于进一步研究。目的：筛选参与白血病多药耐药的miRNA分子,研究miRNA在成人急性髓系白血病中的表达,探讨miRNA分子对AML发生发展与耐药的作用及其机制,为AML的靶向治疗及其逆转耐药提供新的方法。方法：1.应用MTT法检测K562及其耐药株K562/A02对阿霉素(ADM)的耐药性。2.采用real-time RT-PCR检测MDR1表达水平,进一步验证K562/A02细胞的多药耐药性及耐药机制。3.应用microRNA；片技术筛选K562与耐药株K562/A02之间差异表达的miRNA分子,作为候选miRNA分子。4.标本采集：收集39例AML患者的骨髓标本,分为初诊组、难治复发组和完全缓解(CR)组,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞。5. Real-time RT-PCR法检测miRNA的表达情况采用Trizol方法提取细胞总RNA,逆转录试剂盒获得cDNA,应用real-time RT-PCR检测AML患者骨髓单个核细胞候选miRNA表达水平。6.构建候选miRNA的真核表达载体：将差异农达的let-7a构建入pRNAT-U6.1/Hygro质粒中,重组质粒用HindⅢ和EcoRI双酶切验证,同时进行测序。7.建立稳定表达miRNA的细胞系：应用Lipofectamine2000将GFP报高质粒转染K562/A02细胞,Hygromycin B筛选稳定表达microRNADd的潮霉素抗性细胞系。8. Mimic细胞转染：将miR-23a mimic及其阴性对照分别应用Lipofectamine2000转染入K562/A02细胞,48小时后收集细胞,应用real time RT-PCR检测转染后miR-23a表达情况。9. MTT法检测药物敏感性的变化：将不同浓度的阿霉素(ADM)分别加入稳定筛选后的细胞及其对照组,孵育48小时,MTT法检测上调miRNA表达后耐药株K562/A02细胞对化疗药物敏感性的变化,计算阿霉素的IC50值。10.流式细胞术检测K562/A02细胞凋亡情况：将阿霉素分别加入转染miR-23a mimic及阴性对照的K562/A02细胞作用48小时,经AnnexinV/PI染色,流式细胞仪检测上调miR-23a表达对K562/A02细胞凋亡率的影响。11. Real-time RT-PCR法检测上调miR-23a对K562/A02细胞MDR1、MCL1mRNA表达水平的影响,同时以β-actin(?)内参。12.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据分别进行差异性分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.阿霉素对细胞系的IC50值及耐药株K562/A02细胞的耐药倍数：ADM对K562/A02及K562细胞的IC50值分别为18.79±.72μg/ml、0.22±0.03μg/ml, K562/A02相对于K562细胞对ADM的耐药倍数是85.41倍。2. K562/A02和K562MDR1基因的表达：以β-actin基因为内参,K562/A02细胞多药耐药相关基因MDR1的相对表达量为1.24±0.17,明显高于K562细胞(8,19±2.74)×10-6(P<0.05)。3.应用microRNA芯片技术在耐药株K562/A02与K562间筛选出11种表达明显差异的miRNA分子,差异表达均在2倍以上,let-7a、miR-23a、 miR-663、miR-425、miR-122、miR-498、miR-129-5p、miR-144、miR-890在K562/A02细胞中表达下调,而miR-886-5p、miR-886-3p表达上调,选择let-7a、miR-23a、miR-663与miR-144作为候选miRNA分子。4. Real time RT-PCR检测AML患者miRNA表达,发现初诊AML患者miR-144表达水平明显低于CR组(P<0.05)。难治复发AML患者miR-23a较CR组显著降低(P<0.05),初诊组miR-23a表达水平低于CR组,但差异无统计学意义。三组AML患者间let-7a和miR-663表达差异无统计学意义。5.将let-7a插入序列构建入经BamH I和Hind Ⅲ双酶切的pRNAT-U6.1/Hygro载体中,构建重组质粒pRNAT-let-7a。经HindⅢ和EcoRI双酶切,空载体切成3531bp、2667bp和351bp三个片段,构建成功的let-7a表达载体切成3531bp、2667bp和约400bp三个片段。所构建let-7a表达载体经酶切电泳和测序验证正确。6.建立稳定表达let-7a的细胞系：将let-7a表达载体转染K562/A02细胞,用含Hygromycin B200mg/L的培养基筛选转染后的细胞,3周后见稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞克隆形成；更换含Hygromycin B100mg/L的培养基维持培养,1周后荧光显微镜下显示为95%以上细胞可见GFP表达,证明稳定表达let-7a的K562/A02细胞建立成功。7.MTT法检测稳定表达let-7a的K562/A02细胞IC50值为14.64±2.34μg/ml,对照组IC50值为14.19±1.36μg/ml,差异无统计学意义(P=0.846)。8.应用real-time RT-PCR检测细胞转染后miR-23a表达情况,结果显示K562/A02-miR-23a-mimic组细胞与K562/A02-mimic-NC阴性对照组相比较,miR-23a的表达水平明显升高(P<0.01)。9.流式细胞术分析上调miR-23a表达后K562/A02细胞凋亡率的变化,发现K562/A02-miR-23a-mimic组细胞凋亡率为30.65±1.11%,对照组K562/A02-mimic-NC细胞凋亡率为14.46±1.5%,两组比较具有显著性统计学差异(P<0.05)。10.上调miR-23a表达后K562/A02细胞MDR1、MCL1表达情况real-time RT-PCR检测发现K562/A02-miR-23a-mimic组细胞与阴性对照组K562/A02-mimic-NC相比较,MDR1mRNA表达水平明显下降(P<0.05)；而MCL1表达虽低于对照组,但差异无统计学意义(P=0.18)。结论：1.MiRNA在耐药株K562/A02与K562细胞中存在差异表达,提示miRNA可能参与AML耐药产生。2.初诊AML患者存在miR-144异常低农达,难治复发AML患者miR-23a表达显著降低,提示miR-144、miR-23a可能与AML发生发展及耐药有关3.成功构建let-7a真核表达载体,并建立了稳定表达let-7a的K562/A02细胞株,但上调let-7a并不能增加I K562/A02细胞的药物敏感性。4.上调miR-23a表达可促进K562/A02细胞化疗药物诱导的凋亡,并能引起MDR1表达下调,提示miR-23a有望成为AML逆转耐药的新靶点。