论文部分内容阅读
诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)是通过导入四个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等组合,使分化的体细胞进行重编程从而获得一类与胚胎干细胞具有相似特性的新细胞类型。由于iPS细胞同样具备与胚胎干细胞类似的无限增殖、多向分化潜能以及自我更新维持等能力,利用病人自身细胞获得的iPS细胞能减少免疫排斥反应,且它能够很好的避开ES细胞面临的伦理道德问题,因而iPS技术在动物模型的建立、药物筛选以及疾病治疗等领域具有广阔的应用前景。为探讨以耳聋病人体细胞诱导获得iPS细胞的可行性,本论文开展了如下三个方面的研究：1.小鼠MEF诱导成多能性干细胞技术体系优化：探讨通过一种低效的诱导体系,诱导P53基因敲除以及野生型的小鼠胚胎成纤维细胞,获得iPS细胞,进而分析二者Dlk1-Dio3区基因表达差异,研究P53信号通路与Dlkl-Dio3区在体细胞重编程机制作用上可能存在的关联性。结果表明：以四个多潜能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4以及c-Myc为组合,用逆转录病毒载体,介导P53基因全敲型小鼠胚胎成纤维细胞,在一个低效的诱导体系下,获得的小鼠细胞集落AP染色呈弱阳性,为不完全重编程的iPS细胞。而通过慢病毒载体介导,能成功诱导P53+/-小鼠胚胎成纤维,获得的iPS细胞,AP染色呈阳性。RT-PCR检测到内源多能性四因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的表达。免疫荧光染色能检测到多能性相关的细胞核、细胞膜蛋白OCT4、NANOG和SSEA-1等的表达。2.利用非整合Episomal质粒诱导耳聋病人体细胞获得多能性干细胞的初步研究：探讨应用非整合质粒系统获得病人iPS细胞的可行性。结果显示：病人皮肤组织块原代培养第7天,可观察到大量细胞从人耳皮肤组织边缘向外延伸,呈典型的成纤维细胞特征。利用非整合Episomal质粒转染病人耳皮肤成纤维细胞,电转后第5天能明显观察到细胞的形态由原先的梭形慢慢变圆,第15天能观察到一个孔中已出现大量不规则的圆形或椭圆形扁平状的细胞集落,能明显与集落周围的成纤维细胞区分开。取第3代次的人iPS细胞进行碱性磷酸酶染色,可观察到细胞集落被染成深紫色,表现为AP阳性,而对照饲养层细胞则未被着色,呈AP阴性。以人胚胎干细胞H9作为阳性对照组,取第3代的人耳皮肤成纤维细胞诱导的iPS细胞,用小鼠、大鼠、兔子来源的OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1抗体作为一抗,经过免疫荧光染色后观察显示：人iPS细胞表达人胚胎多能性干细胞细胞核蛋白OCT-4、NANOG以及细胞膜蛋白SSEA-3、SSEA-4。未检测到小鼠多能性干细胞特异性膜蛋白SSEA-1的表达。细胞用Hochest33342染细胞核,观察到多能性核蛋白OCT-4、NANOG能与Hochest33342染的细胞核重合；而多能性细胞细胞膜特异性表达的SSEA-3、SSEA-4分布在Hochest33342染的细胞核周围,呈网格状分布；未能在iPS克隆上观察到小鼠多能性干细胞特异性的SSEA-1的表达。证明了本实验电转得到的iPS细胞来源于人耳皮肤成纤维细胞,并非小鼠胚胎成纤维细胞。3.通过在293T细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人间充质干细胞(MSC)、人胚胎干细胞(人ESC)等不同类型细胞的培养液中添加Selleckchem公司生产的支原体去除试剂,最终确定该试剂的作用效果。结论：以四个多潜能性转录因子OSKM为组合,用慢病毒载体比逆转录病毒载体更容易诱导P53基因全敲型小鼠胚胎成纤维细胞为iPS。通过非整合Episomal载体转染的方法,可以获得耳聋病人体细胞来源的人iPS,为探讨应用iPS细胞对耳聋病人进行治疗性细胞移植研究奠定了基础。