动脉缺血性疾病是一类严重威胁人类健康的血管疾病,目前尚无有效的治疗药物。重组人肝细胞生长因子(HGF)裸质粒(以下简称:NL003)是用于治疗缺血性疾病的重组裸质粒基因治疗药物。将裸质粒注射于缺血部位肌肉组织时,裸质粒会转染横纹肌细胞,并利用横纹肌细胞的蛋白合成系统,合成和分泌具有促进血管生长作用的HGF蛋白分子,它将促进缺血部位侧支循环形成,从而达到治疗动脉缺血性疾病目的。NL003项目还未进行规模化生产工艺的研究,为促进本项目早日实现产业化,本论文选择为其建立规模化生产工艺、建立主要质量控制指标、以及终产品对缺血性动物模型的治疗效果实验作为主要研究内容。第一部分,工程菌的培养工艺研究,首先在摇瓶条件下研究了适宜NL003工程菌的生长和质粒扩增的条件;并在此基础上,通过研究培养基成分、培养时间以及接种量对工程菌生长与质粒产量的影响,首次确定了工程菌在30L发酵罐中的适宜发酵工艺:选择含有机氮源与微量元素的培养基、接种比例在1:18到1:9之间、37℃、通气量20L/min、溶氧全程控制在20%以上、pH全程控制在7.0、在发酵期间流加浓度为50%的葡萄糖补充液至结束、发酵10 h后离心收集菌体。第二部分,通过对目的质粒纯化工艺研究,确定了NL003项目小试纯化工艺流程为:碱裂解破菌、超滤浓缩、第一步层析(完全去除RNA)、第二部层析(纯化超螺旋质粒DNA)和第三部层析(去除残余内毒素)。在此基础上,按照层析柱直径增大、层析介质高不变和线性流速不变的原则进行了工艺的放大研究,确定了10倍的放大工艺。并按照此工艺连续生产了三批样品,得到的目的质粒各项指标均符合所制定的质量标准,实验结果表明纯化工艺的稳定性。第三部分,终产品主要质量控制指标研究,结合2010版《中国药典》第三部的要求,建立了NL003项目的质粒含量和生物活性的测定方法。质粒含量测定方法为:采用吸光度法计算质粒含量;生物学活性测定方法为:首先用药物转染细胞后产生表达产物,再用间接的利用表达产物促进细胞迁移。第四部分,将上述工艺制备的样品用于下肢缺血性疾病模型的治疗效果研究,评价了NL003对家兔下肢缺血性模型的血管及侧支循环再形成作用。实验结果表明,本项目能促进缺血部位侧支血管生成、在肌肉组织中促进毛细血管生成、增加髂内动脉血流量等作用,且与实验对照组比较,具有统计学差异。