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目的:
探讨七氟烷和异氟烷急性暴露对SD仔鼠海马的神经毒性作用及机制。
方法:
建立吸入性麻醉药急性暴露模型。将90只出生7d的雄性SD仔鼠随机分组如下:对照组(C0组)、七氟烷组(S0组)和异氟烷组(I0组)。对照组大鼠在含60%氧的空氧混合气中暴露6h,七氟烷组和异氟烷组大鼠在3.6%七氟烷和2.3%异氟烷中暴露6h。将暴露结束后存活的SD仔鼠分成以下三部分进行取材检测:透视电镜观察海马神经元形态学的改变;TUNEL和活化Caspase-3片段的免疫组化技术(IHC)检测神经元凋亡;WesternBlotting检测活化Caspase-3表达。另将210只出生7d的雄性SD仔鼠随机分为对照组(C组)、七氟烷组(S组)、七氟烷+蝇蕈醇组(S+M组)、七氟烷+荷包牡丹碱组(S+B组)、异氟烷组(I组)、异氟烷+蝇蕈醇组(I+M组)和异氟烷+荷包牡丹碱组(I+B组)。在急性暴露前0.5hS+M组、I+M组和S+B组、I+B组分别腹腔注射蝇蕈醇(Muscimol)和荷包牡丹碱(Bicuculline);激动剂和拮抗剂的给药剂量分别是1mg/kg、8mg/kg;其余组别分别腹腔注射等体积的生理盐水。急性暴露结束后待SD仔鼠完全复苏后取出存活的SD仔鼠继续母乳喂养直到21d断奶,随后从每组中取出6只SD大鼠进行连续7天的Morris水迷宫实验;行为学实验结束后取材进行GABA-A受体α1亚基和BDNF(脑源性神经生长因子)的免疫组织化学实验。同时各组其余的SD大鼠同时进行海马取材,用于GABA-A受体α1亚基和BDNF(脑源性神经生长因子)的RT-PCR实验。
结果:
1、形态学变化
透视电镜见七氟烷(S0组)组和异氟烷组(I0组)大鼠海马神经元内有残缺不全的细胞核、肿胀的线粒体和内质网;对照组(C0组)中的细胞核、线粒体和内质网形态正常。
2、细胞凋亡检测
IHC显示:与正常对照组(C0组)相比,七氟烷组(S0组)和异氟烷组(I0组)海马神经元凋亡显著增加。TUNEL显示:与正常对照组(C0组)神经元凋亡数量(2±2)相比,七氟烷组(S0组)和异氟烷组(I0组)海马神经元凋亡数量显著提高,分别为(13±2)和(22±5),且异氟烷组与七氟烷组神经元凋亡数相比有统计学差异(P<0.05)。
3、Caspase-3蛋白质表达情况
采用免疫蛋白印迹法(WesternBlotting)测定对照组(C0组)、七氟烷组(S0组)和异氟烷组(I0组)样品中活化Caspase-3蛋白质含量,结果显示七氟烷组和异氟烷组活化Caspase-3表达显著增加(P<0.05),且在等效浓度下异氟烷组强于七氟烷组(P<0.05)。
4、行为学改变
应用Morris水迷宫方法检测吸入性麻醉药急性暴露后空白对照组(C组)、七氟烷组(S组)、七氟烷+蝇蕈醇组(S+M组)、七氟烷+荷包牡丹碱组(S+B组)、异氟烷组(Ⅰ组)、异氟烷+蝇蕈醇组(Ⅰ+M组)和异氟烷+荷包牡丹碱组(Ⅰ+B组)SD大鼠的短期学习记忆和认知功能,结果发现:与C组相比,S组、Ⅰ组的潜伏期和潜伏距离显著延长;与S组相比,S+B组、S+M组的潜伏期和潜伏距离无明显变化;与Ⅰ组相比,Ⅰ+B组、Ⅰ+M组的潜伏期和潜伏距离无明显变化。
5、海马BDNF和GABA-A受体α1亚基表达
5.1免疫组织化学
免疫组织化学结果显示:与C组相比,S组、Ⅰ组BDNF蛋白表达显著降低;与S组相比,S+B组、S+M组BDNF蛋白表达无明显变化;与Ⅰ组相比,Ⅰ+B组、Ⅰ+M组BDNF蛋白表达无明显变化;与C组相比,S组、Ⅰ组的GABA-A受体α1亚基蛋白表达无明显变化;与S组相比,S+B组、S+M组的GABA-A受体α1亚基蛋白表达无明显变化;与Ⅰ组相比,Ⅰ+B组、Ⅰ+M组的GABA-A受体α1亚基蛋白表达无明显变化。
5.2RT-PCR实验
RT-PCR实验结果显示:与C组相比,S组、Ⅰ组BDNF的mRNA表达显著降低;与S组相比,S+B组、S+M组BDNF的mRNA表达无明显变化;与Ⅰ组相比,Ⅰ+B组、Ⅰ+M组BDNF的mRNA表达无明显变化;与C组相比,S组、Ⅰ组的GABA-A受体α1亚基的mRNA表达无明显变化;与S组相比,S+B组、S+M组的GABA-A受体α1亚基的mRNA表达无明显变化;与Ⅰ组相比,Ⅰ+B组、Ⅰ+M组的GABA-A受体α1亚基的mRNA表达无明显变化。
结论:
1、七氟烷和异氟烷急性暴露可致发育中神经元的凋亡;在等效浓度下异氟烷能引起更严重的神经元损伤。
2、七氟烷和异氟烷急性暴露能够显著降低SD大鼠幼年期学习记忆和认知功能。
3、七氟烷和异氟烷急性暴露不是通过GABA-A受体引起SD大鼠幼年期的学习记忆和认知功能障碍,其机制可能部分与BDNF表达含量的高低有关。