研究背景和目的结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是人类常见的消化系统恶性肿瘤,在我国恶性肿瘤死因顺位排名中居于第三位。目前结直肠癌的治疗方法主要以手术切除为主,术后辅以化学药物治疗。即使如此,仍有相当部分患者出现术后复发,导致治疗失败。干性及耐药性的形成是化疗失败并引起结直肠癌复发、转移及患者死亡的主要原因。因此明确结直肠癌细胞获得干性和耐药性的分子机制至关重要,可能会为结直肠癌的临床治疗提供新的思路和方案。TUSC3(tumor suppressor candidate3)基因,也称作 D8S1992、M33、MRT22、MRT7、N33和OST3A等,广泛表达于人体组织如脑、心脏、肺和肝脏等组织。TUSC3在细胞内主要位于内质网,在催化蛋白质N-糖基化的过程中起着非常重要的作用,而N-糖基化生物过程与肿瘤发生发展过程有着重要联系。TUSC3还是参与Mg2+转运的重要成员,调节机体Mg2+的吸收,当TUSC3表达不足时可导致Mg2+吸收障碍,进而导致机体发育障碍,TUSC3的缺失是阿尔兹海默症和帕金森症的重要发病原因之一。TUSC3在多种肿瘤中被认为是一种抑癌基因,如前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等,本课题组前期的研究显示在结直肠癌中,TUSC3有着明显的促进结直肠癌细胞侵袭和转移的作用。我们通过生物信息学分析,推测TUSC3可能与结直肠癌的干性和耐药性相关。本课题通过研究TUSC3在结直肠癌组织和细胞中的表达及其与结直肠癌细胞的干性和耐药性的关系,检测TUSC3与(Hedgehog)HH信号通路之间的相关性,初步探讨了 TUSC3调控结直肠癌细胞干性和耐药性的分子机制,以期为寻找结直肠癌治疗新靶点提供理论基础和实验依据。方法1、TUSC3在结直肠癌组织和细胞系中的表达及临床意义采用qRT-PCR实验检测38例结直肠癌组织和配对癌旁组织中TUSC3 mRNA表达水平,采用免疫组化技术检测90例结直肠癌组织与配对癌旁组织中TUSC3蛋白表达水平,并分析TUSC3表达与结直肠癌患者临床病理参数之间的相关性。采用western blot和qRT-PCR技术检测TUSC3在7株不同的结直肠癌细胞系和1株正常结肠上皮细胞系FHC中的蛋白和mRNA表达水平,并筛选出TUSC3相对高表达和相对低表达的细胞系各两株。使用GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)和抗癌药物敏感性基因组学(GDSC,Genomics of Drug Sensitibity in Cancer,https://www.cancerrxgene.org/)数据库研究 TUSC3 在结直肠癌中的表达水平以及临床意义,分析TUSC3与结直肠癌分期、耐药和生存预后之间的关系。2、TUSC3调控结直肠癌细胞干性和耐药性的功能研究首先构建TUSC3过表达质粒并进行慢病毒包装,对TUSC3表达量较低的两株细胞系进行转染处理,其次设计并合成4个TUSC3的shRNA片段,对表达量较高的两株细胞系进行转染处理,并筛选出干扰效率最高的一个进行后续实验,分别以空载病毒转染后的细胞系作对照组,通过western blot和qRT-PCR方法确定转染效率与表达水平的变化。采用细胞成球实验诱导结直肠癌干细胞,检测TUSC3在结直肠癌干细胞中的相对表达水平,并检测TUSC3过表达、沉默之后结直肠癌细胞成球能力的变化,以及干性标记物蛋白表达水平变化,以明确TUSC3是否在调控结直肠癌细胞干性过程中起作用;过表达或沉默TUSC3的表达之后,采用MTT实验检测结直肠癌细胞耐药性的变化,并检测相关耐药标记物蛋白表达水平变化,采用流式细胞术检测结直肠癌细胞凋亡水平的变化,采用裸鼠皮下瘤实验检测TUSC3体内耐药性的变化,以明确TUSC3表达改变是否可影响结直肠癌细胞的耐药性。分别采用qRT-PCR实验、组织芯片技术和组织免疫荧光双标实验检测TUSC3在结直肠癌组织中与干性标记物CD133和耐药标记物ABCC1的蛋白和mRNA表达相关性。3、TUSC3调控结直肠癌细胞于性和耐药性的分子机制研究在明确TUSC3调控结直肠癌细胞干性和耐药性之后,我们对其具体分子机制进行了研究,通过分析TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)以及TUSC3差异表达基因芯片,筛选出HH信号通路,采用免疫组化技术检测HH信号通路蛋白在结直肠癌组织和癌旁组织的表达水平,采用western blot实验和免疫荧光实验检测结直肠癌细胞系在过表达、沉默TUSC3之后HH信号通路的关键蛋白的表达水平变化,明确TUSC3与HH信号通路之间的关系;然后将TUSC3过表达、沉默之后的细胞系分别处理HH信号通路抑制剂和HH信号通路激动剂,观察相关功能和蛋白表达的变化,进一步明确TUSC3对结直肠癌干性和耐药性调控的分子机制;最后,采用免疫共沉淀实验和免疫荧光实验筛选HH信号通路与TUSC3蛋白具有相互作用关系的蛋白,并采用糖基化实验检测该蛋白的N-糖基化水平。结果1、TUSC3在结直肠癌组织和细胞系中的表达及其临床意义分析(1)qRT-PCR实验和免疫组化实验结果显示TUSC3在结直肠癌组织中表达水平增高,并且与结直肠癌患者T、N和M分期显著正相关(p<0.05);(2)qRT-PCR实验和western blot实验结果显示TUSC3在多数结直肠癌细胞系中mRNA水平和蛋白水平均高于正常结肠上皮FHC;(3)GEPIA网站分析结果显示TUSC3与结直肠癌患者TNM分期显著正相关,与术后无病生存期和术后总生存期均呈显著负相关关系(p<0.05)。2、TUSC3调控结直肠癌细胞的干性(1)使用基因芯片筛选TUSC3下游差异表达基因,结果显示TUSC3在结直肠癌细胞中与多种干性基因(Lgr5和CD133等)表达相关;(2)组织免疫荧光结果显示TUSC3与结直肠癌干性标记物CD133表达相关;(3)细胞成球实验结果显示TUSC3表达水平较高的SW620细胞成球效率高于TUSC3表达水平较低的CAC02细胞,western blot实验结果显示成球细胞中Lgr5蛋白和CD133蛋白表达水平增高,确定为结直肠癌干细胞,并且相对于对照组细胞,TUSC3在结直肠癌干细胞中的表达水平增高;(4)过表达TUSC3后,结直肠癌细胞系成球能力增强,并且结直肠癌干性标记物Lgr5和CD133表达水平增加。沉默TUSC3的表达之后,结直肠癌细胞成球能力减弱,并且结直肠癌干性标记物Lgr5和CD133的表达水平降低;(5)qRT-PCR实验和组织芯片免疫组化实验结果显示在结直肠癌组织中,TUSC3和CD133在mRNA水平和蛋白水平的表达均呈显著正相关关系(p<0.01)。3、TUSC3调控结直肠癌细胞的耐药性(1)分析GDSC数据库结果显示TUSC3基因与结直肠癌细胞系对5-氟尿嘧啶和顺铂的耐药性正相关;(2)组织免疫荧光结果显示TUSC3和结直肠癌耐药标记物ABCC1表达相关;(3)过表达TUSC3之后,MTT实验结果显示结直肠癌细胞系对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性降低,流式细胞术分析结果显示TUSC3过表达抑制结直肠癌细胞在处理5-氟尿嘧啶后的凋亡率,western blot实验结果显示ABCC1和ABCC6的蛋白表达水平增高;(4)沉默TUSC3之后,MTT实验结果显示结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性增高,流式细胞术分析结果显示敲除TUSC3促进结直肠癌细胞在处理5-氟尿嘧啶后的凋亡率,western blot实验结果显示ABCC1和ABCC6的表达水平降低;(5)裸鼠皮下瘤实验结果显示敲除TUSC3之后结直肠癌细胞的体内耐药性呈上升趋势,差异无统计学意义(p>0.05)。4、TUSC3调控结直肠癌细胞干性和耐药性的分子机制分析TCGA数据库及TUSC3差异表达基因芯片,从中筛选获得TUSC3在结直肠癌中的下游信号通路——HH信号通路。免疫组化实验证实HH信号通路在结直肠癌中广泛激活,western blot实验揭示HH信号通路的正调控因子SMO、Gli1蛋白等在结直肠癌中表达水平增高;我们接着对TUSC3过表达细胞系使用HH信号通路抑制剂,对TUSC3沉默细胞系使用HH信号通路激动剂,结果显示由TUSC3表达改变所引起的结直肠癌细胞干性、耐药性及相关蛋白表达的改变均消失,进一步证实TUSC3是通过HH信号通路调控结直肠癌细胞的干性和耐药性。免疫共沉淀结果显示TUSC3与HH信号通路中的SMO蛋白有着直接相互作用关系,免疫荧光实验结果显示TUSC3蛋白和SMO蛋白存在空间上的重叠,糖基化实验结果显示SMO蛋白是一种N-糖基化修饰,结合TUSC3的生物学功能,我们推测TUSC3可能通过参与SMO蛋白翻译后N-糖基化修饰,激活HH信号通路,并转录活化相应靶蛋白,从而促进结直肠癌细胞干性和耐药性。结论TUSC3在结直肠癌组织和细胞中高表达,与结直肠癌患者TNM分期及不良预后相关;过表达TUSC3可促进结直肠癌细胞的干性和耐药性,其分子机制可能为通过参与HH信号通路中的SMO蛋白翻译后N-糖基化修饰使HH信号通路异常激活,从而促进结直肠癌细胞的干性和耐药性。因此,靶向TUSC3有可能为结直肠癌的临床治疗提供新思路和理论依据。本研究的创新之处1通过分析临床标本资料、在线数据库和基础实验阐明TUSC3在调控结直肠癌细胞干性和耐药性中所起的作用;2在细胞模型和分子水平揭示TUSC3调控结直肠癌细胞干性和耐药性的分子机制,为寻找结直肠癌治疗靶点提供理论基础和实验依据。