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第一章 FGF-2基础表达的转录调控机制
目的:成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)是肝素结合生长因子家族的一员,在心血管系统,FGF-2表达于多种心血管细胞,包括各个发育阶段的心肌细胞和血管细胞。大量的研究结果表明FGF-2在心肌保护、炎症应答、血管发生、血管重构、心肌肥厚、心肌纤维化和缝隙连接传导过程中发挥重要作用。然而,介导心肌细胞FGF-2基因基础表达活性的正性转录调控因子,还未见报道。因此,我们探讨了FGF-2基础表达的转录调控机制。
方法和结果:本研究以体外培养的新生SD大鼠的心肌细胞作为试验模型。构建了一系列缺失突变的FGF-2启动子报告质粒,瞬时转染心肌细胞。缺失分析显示FGF-2启动子-16~+59序列是维持新生大鼠心肌细胞启动子活性最关键的区域。计算机软件分析发现该区域存在三个可能的刺激蛋白1(Sp1)的作用序列,-3,+14和+27。凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)显示-3和+14区域存在两个非典型的Sp1结合序列。分别突变这两个结合序列都可以引起FGF-2启动子活性的明显下降,同时突变这两个序列几乎完全取消了启动子的活性。而仅突变+27序列对启动子活性几乎没有影响。最后,染色质免疫沉淀分析揭示Sp1在心肌细胞内可以结合于FGF-2启动子区域。
结论:乳鼠心肌细胞FGF-2的基础表达与转录因子Sp1有关。
1.启动子-16~+59序列内至少存在一个上调FGF-2转录活性的核心序列。
2.Sp1作用于FGF-2启动子-3和+14位点的两个特异性结合域,调节FGF-2转录。
3.Sp1可以直接与心肌细胞内的FGF-2启动子结合。
第二章参与AngⅡ上调FGF-2表达的信号通路和转录因子
目的:在心肌细胞肥厚过程中,参与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导转录因子激活的信号通路,目前仍不太清楚。肥厚的心脏有许多基因表达上调,其中包括成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。本研究的目的是探讨AngⅡ诱导FGF-2表达的分子机制。
方法:本研究以体外培养的新生SD大鼠的心肌细胞作为试验模型,应用实时定量PCR和蛋白免疫印迹(western blot)技术,免疫荧光分析,观察了AngⅡ诱导新生大鼠心肌细胞FGF-2 mRNA和蛋白表达的量效和/或时效关系;血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡ type1 receptor,AT1R)阻断剂缬沙坦,丝裂原活化的蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)抑制剂U0126、p38激酶抑制剂SB203580和c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对AngⅡ作用的影响;Western blot分析,研究AngⅡ对p44,42MAPK和p38 MAPK的磷酸化水平的影响;瞬时转染和缺失分析寻找FGF-2启动子区潜在的AngⅡ效应元件;凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)证实转录因子与启动子的特异性结合,以及U0126和SB203580对此作用的影响。
结果:
1.AngⅡ分别从mRNA和蛋白水平上调了新生大鼠心肌细胞FGF-2的表达,这些作用被缬沙坦、U0126和SB203580削弱,而SP600125对此作用无明显影响。
2.AngⅡ可以增加心肌细胞p44,42MAPK和p38 MAPK的磷酸化程度。
3.FGF-2启动子-845~-666序列内存在潜在的AngⅡ效应元件。
4.FGF-2启动子-752位置存在一个非典型的GATA结合域;AngⅡ可以增加GATA和DNA的结合活性,该作用被U0126和SB203580部分拮抗。另外,GATA-4抗体削弱了GATA-DNA的结合活性,而GATA-6抗体和NFκB抗体没有这种作用。
结论:AngⅡ作用于AT1R,通过MAPK信号传导级联反应中的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及P38激酶信号通路介导增加了GATA-4与FGF-2启动子的结合,使FGF-2表达上调。
1.AngⅡ作用于AT1R,通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路使FGF-2表达上调。
2.FGF-2启动子-845~-666序列内存在潜在的AngⅡ效应元件。
3.AngⅡ通过激活ERK1/2,p38 MAPK,增加GATA-4与FGF-2启动子的结合。