背景和目的：超声造影剂(ultrasound contrast agent, UCA)是在超声成像中用来增强图像对比度的物质。经过近四十年的发展,超声造影剂已由壳膜包裹惰性气体的第二代发展到链接配体实现特异性分子成像的第三代造影剂—靶向微泡,由血池示踪的微米级泡发展到能透过病灶新生血管内皮实现病变组织成像的纳米级泡。第三代超声造影剂应用于临床还需要解决几大问题,其中的关键问题是造影剂的表面修饰,即如何将特异性好、活性高的配体牢固高效地结合到微泡表面。但目前的造影剂(包括白蛋白类及磷脂类)缺乏活性基团,不易与配体链接以致配体结合率低下,而且粒径过大,不能透过病变血管内皮实现病灶定点成像,已经不能满足靶向造影剂的发展需要。因此研究开发易修饰的新型UCA具有巨大的研究和实际应用价值。大量研究表明多聚合物及多糖类材料价格相对低廉,含有大量的活性基团,易于修饰,是目前乃是将来超声造影剂研制中最具有前途的包膜材料。壳聚糖集聚合物和多糖材料的优点于一身,表面活性优良,它不但无毒、无刺激性,生物可降解性及生物相容性良好,而且具有独特的生理和药理活性,已经被广泛各种生物医学领域。但壳聚糖水溶性差,要想用作壳膜材料必须对其进行结构修饰或加入特定的交联剂。有报道采用N-羧甲基壳聚糖制备UCA,但制备工艺复杂,且容易产生交联剂戊二醛和正己烷的残留。蒋刚彪等将软脂酰基引入壳聚糖分子中制备出两亲性壳聚糖高分子胶束--N-软脂酰基壳聚糖(N-palmitoyl chitosan, PLCS)。这种两亲性衍生物具有优良的增溶、乳化和自组装(自聚集)能力,最重要的是它含有丰富的自由氨基和羟基等活性基团,具有良好的修饰性,可以与许多药物、基因或配体进行共价链接而无需额外添加锚点,而且这种化学修饰所需的反应条件温和,有利于保持链接物的生物活性。因此它是一种理想的微泡壳膜材料。本研究的目的是采用N-软酯酰基壳聚糖为壳膜材料,制备新型的超声微泡及纳泡,用光学显微镜、Coulter计数仪、Zeta电位仪检测其大小、形态、浓度和表面电位,通过动物超声进行造影效果的评价。通过改变辅助材料的剂量来优化微泡配方并探讨这些材料在壳聚糖微泡制备中的作用及其机理。材料和方法：1.N-软脂酰基壳聚糖微泡(N-palmitoyl chitosan microbubbles, PCMB)的优化实验1.1 PCMB的制备将适量PLCS.十八醇缩水甘油醚(Octadecyl glycidylether, OGE)、PEG-4000等壳膜材料加入15ml蒸馏水中,在50℃水浴条件下轻轻搅拌溶解90min,定容至20ml,置入50ml注射器内,从注射器底部通入全氟丙烷气体。将剪切仪置入液面下2.5cm处,以剪切仪第5档(21000r/min)剪切40s后转第6档(24000 r/min)剪切80s。微泡制备后分装入安培瓶中,填充全氟丙烷气体并密封瓶口,4℃冰箱保存备用。1.2 PCMB粒径优化方案按照上述制备方法,将PLCS (0.03g)剂量不变,分别加入0%、0.5%、1%、5%浓度的PEG-4000,制备成四组PCMB(分别为PEG 0%组、PEG 0.5%组、PEG 1%组、PEG 5%组),以了解PEG-4000对PCMB粒径、浓度、表面电位的影响；再将PLCS (0.03g)剂量不变,分别加入0g、0.0015g、0.003g、0.006g的十八醇缩水甘油醚,制备成四组PCMB(分别为OGE 0g组、OGE 0.0015g组、OGE 0.003g组、OGE 0.006g组),以了解十八醇缩水甘油醚对PCMB粒径、浓度、表面电位的影响。各组PCMB均制备6个批次。1.3 PCMB理化性质检测每组壳聚糖微泡均取一小滴滴至血细胞计数板上,用光学显微镜观察微泡的形态、大小、分布；取50μ1 PCMB稀释2000倍后用库尔特计数仪测定微泡的浓度和平均粒径；取100μl微泡稀释50倍用Zeta电位仪分析微泡表面电位值。2优化后N-软脂酰基壳聚糖微泡的性能检测2.1优化后PCMB的制备将0.03g PLCS、0.003g十八醇缩水甘油醚、0.2gPEG-4000制备PCMB,制备步骤同步骤(1.1)。2.2优化后PCMB的理化性质检测微泡的形态、大小、分布的检测步骤同步骤(1.3)。取微泡制备后、2个月后、6个月后三个时间段进行上述检测以评价PCMB的体外稳定性。2.3优化后PCMB的超声造影检测造影剂分为：PCMB1组(制备后)、PCMB2组(制备后4℃保存6个月)、全氟显组。每只大鼠经尾静脉依次团注上述三种造影剂0.1ml,注射后用少量生理盐水冲管。逐次行左心室、肝脏、肾脏超声造影检查。重复注射时间隔时间大于15min。超声造影使用Sequoia512超声诊断仪,将超声探头分别固定于大鼠左心室、肝脏、肾脏体表,待二维图像调整满意后,超声探头位置、仪器增益、扫描深度保持不变,以CPS模式行超声造影检测并将全部造影结果存储于DVD盘中。超声图像用Siemens Syngo ACQ分析系统分析,获取峰值强度、达峰时间、峰值减半时间、廓清时间等参数。3 N-软脂酰基壳聚糖纳泡的制备及其理化性质检测3.1纳泡的制备取适量N-软脂酰基壳聚糖加入蒸馏水15ml,余制备步骤同步骤(1.1)。3.2纳泡基本特征及稳定性的测定纳泡制备后于24小时、45天、90天分别进行下列检测：通过光学显微镜和透射电镜观察纳泡的形态,马尔文粒度分析仪检测纳泡的大小,Zeta电位仪分析纳泡表面电位。3.3纳泡超声造影检测检测步骤同步骤(2.3)。每只大鼠经尾静脉注入0.1ml纳泡,行大鼠肾脏、心脏超声造影检测。结果：1 N-软脂酰基壳聚糖微泡的优化实验1.1 PEG-4000对PCMB的影响未加入PEG-4000的PCMB为细小而大小均一的纳泡,浓度最高,为(6.52±0.48)×109个/ml,平均直径为(601±20)nm,表面电位为(52.3±0.5)mV；加入PEG-4000后,微泡浓度逐渐降低,粒径逐渐增大,达到微米级；当PEG-4000的浓度达到1%时,PCMB浓度为(2.21±0.58)×109个/ml,平均粒径为(1277±31) nm。PEG-4000的浓度与PCMB的表面电位呈反比关系,PEG-4000剂量越大,PCMB表面电位越低。1.2十八醇缩水甘油醚对PCMB的影响未加入OGE的PCMB为细小而大小均一的纳泡,平均直径为(601±20)nm,浓度最高,为(6.52±0.48)×109个/ml,表面电位为(52.3±0.5)mV；加入OGE后造影剂的浓度逐渐降低；当加入小剂量的OGE(0.0015g)时,PCMB的粒径却较前明显增大,达到亚微米级,平均粒径为(1315±24)nm；继续增加OGE的用量则PCMB的粒径逐渐下降。OGE对PCMB表面电位没有显著影响。2优化后PCMB的性能检测2.1优化PMCB的理化特征检测微泡浓度为(2.88±0.45)×109/ml,平均粒径为(1.31±0.07)μm,表面电位为(43.4±1.3)mV。微泡保存2个月及6个月后浓度和大小与制备初时差异无统计学意义。PCMB的浓度显著高于全氟显[(2.88±4.49)×109/ml比(1.34±0.34)×109/ml,P<0.001],平均直径则明显小于全氟显[(1.31±0.07)μm比(2.87±0.40)μm,P<0.001]。2.2超声造影效果2.2.1 PCMB与全氟显超声造影比较两者峰值强度和达峰时间差异均无统计学意义(P>0.05)；PCMB的峰值减半时间和廓清时间则长于全氟显[其中峰值减半时间约为(4-5.5)min比(2-3)min,廓清时间约为(7-9)min比(3-4.5)min,P<0.05]。2.2.2保存6个月的PCMB与刚制备的PCMB超声造影比较两者峰值强度和达峰时间差异无统计学意义；肾脏造影时两者峰值减半时间和廓清时间相近,而心脏和肝脏造影时前者较后者缩短[其中心脏造影分别为(245.9±21.8)s比(316.0±23.9)s,(399.9±22.7)s比(545.4±18.1)s；肝脏造影分别为(233.6±17.5)s比(336.4±22.9)s,(394.6±23.0)s比(489.9±29.4)s,P<0.001]。3 N-软脂酰基壳聚糖纳泡的制备及其理化性质检测3.1纳泡理化性质和稳定性显微镜和透射电镜下观察,各时间点纳泡均呈空心球形结构、大小较均一、无聚集现象。静置24h后的纳泡平均粒径为(612±14)nm,浓度为(7.1±0.5)×109/ml, Zeta电位为(52.3±0.5)mV。与制备后24h的纳泡相比,静置45天和90天后纳泡平均粒径、浓度和Zeta电位之间差异均无统计学意义(P>0.05)。3.2纳泡超声显像检测大鼠肾脏、心脏超声显影得到明显增强。肾脏对比显影最大声强度为(15-17)GU,心脏对比显影最大声强度为(26-30)GU,在两种组织中可视性显影增强持续时间为10min左右。结论：1.以N-软脂酰基壳聚糖、十八醇缩水甘油醚和PEG为壳膜材料成功制备出一种新型亚微米级超声微泡,体外稳定性好；行大鼠超声造影显示超声显像效果理想,体内循环时间长于全氟显。2.十八醇缩水甘油醚OGE可增加PCMB的粒径,当与PLCS质量比超过1：10时不再产生这种作用；对PCMB表面电位不产生显著影响。聚乙二醇有助于增加微泡的粒径,并使粒径分布变窄；能显著降低微泡的表面电位。3.以N-软脂酰基壳聚糖为壳膜成功制备一种新型超声纳泡,平均粒径<700nm,浓密而均一,大鼠超声造影显示超声显像效果理想,体内循环时间长。