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目的：缺血性脑血管病(Ischemic cerebrovascular diseases, ICVD)是死亡率和致残率较高的疾病之一。脑缺血再灌注损伤是ICVD的主要病理过程，再灌注过程中，由于氧化应激反应导致血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)破坏，引起局部或广泛的通透性增加，导致脑神经继发性损伤。因此，抗氧化应激损伤、保护BBB对脑缺血再灌注损伤的治疗及预后具有重要意义。本实验室前期研究证明天麻乙酸乙酯提取部位具有抗脑缺血作用，并从该部位分离出单体酚性成分1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#。本研究拟以小鼠脑毛细血管内皮细胞株(bEnd.3)及星形胶质细胞(astrocyte)作为血脑屏障研究的模型，从中筛选具有保护BBB的活性成分并探讨其抗氧化应激相关的作用机制，为其进一步开发利用奠定基础。方法：1．复制血脑屏障氧化损伤模型：BBB主要由血管内皮细胞和星形胶质细胞组成，故本实验以bEnd.3细胞和astrocyte细胞作为血脑屏障模型进行研究，采用国际通用的过氧化氢(H2O2)诱导细胞氧化损伤的方法复制血脑屏障损伤模型。以0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM H2O2诱导bEnd.3细胞和astrocyte损伤4h；再以0.5mM H2O2诱导bEnd.3细胞损伤1h、2h、4h、6h，以检测LDH泄漏率筛选H2O2诱导bEnd.3细胞和astrocyte细胞氧化损伤的最佳条件。2．天麻乙酸乙酯提取部位保护血脑屏障活性成分的筛选：以筛选的H2O2诱导氧化损伤最佳条件测定天麻乙酸乙酯提取部位酚性成分1#-8#对bEnd.3细胞LDH泄漏率的影响，探讨天麻活性成分1#-8#对血脑屏障中的血管内皮细胞的作用，初步筛选出具有保护BBB的活性成分。3．天麻活性成分保护血管内皮细胞bEnd.3作用机制的研究课题来源：基于脑内分布的天麻酚性成分对缺血性脑损伤神经保护及机制的研究（81160514）3.1天麻活性成分对血管内皮细胞增殖的影响：利用Alamar blue法检测天麻活性成分对bEnd.3细胞是否具有促进生长的作用，探讨其对血管内皮细胞增殖的影响。3.2用Western-blot(WB)法和细胞免疫荧光法检测天麻活性成分对bEnd.3中紧密连接蛋白claudin-1, claudin-5, occludin含量的变化；并用WB法检测Nrf2/ARE通路中Nrf2, HO-1, NQO1含量变化；探讨天麻活性成分保护bEnd.3的作用机制。4．天麻活性成分保护星形胶质细胞的作用及作用机制研究4.1以测定LDH泄漏率观察天麻活性成分对氧化应激诱导astrocyte损伤的保护作用。4.2以Western-blot法测定天麻活性成分对正常星型胶质细胞和H2O2诱导的星型胶质细胞氧化损伤状态下Nrf2及其下游蛋白BDNF, HO-1, NQO1表达的影响，探讨天麻活性成分保护星型胶质细胞的作用机制。结果：1．天麻乙酸乙酯提取部位酚性成分对血脑屏障中血管内皮细胞的保护作用及机制1.1H2O2诱导bEnd.3细胞损伤的LDH泄漏率与正常组比，0.25mM、0.5mM、0.75mM H2O2诱导bEnd.3细胞损伤4h，差异有统计学意义(P＜0.01)；0.5mM H2O2诱导bEnd.3细胞损伤6h差异有统计学意义(P＜0.01)。故以0.5mM H2O2作用于细胞4h作为H2O2造成bEnd.3细胞损伤最佳条件。1.2天麻酚性成分1#、2#、4#、7#的不同浓度(15μg/ml,25μg/ml,50μg/ml, C4:100μg/ml)对H2O2诱导bEnd.3细胞损伤的LDH泄漏率无影响。天麻酚性成分3#、5#、6#的不同浓度(12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml)及天麻酚性成分8#不同浓度(5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml)可降低H2O2诱导bEnd.3细胞损伤的LDH泄漏率，差异有统计学意义(P<0.01)。1.3天麻酚性成分3#、5#对bEnd.3细胞增殖有一定的促进作用，酚性成分6#、8#未见有促进细胞生长的作用。1.4与正常组比，天麻酚性成分5#可增加bEnd.3细胞中紧密连接蛋白claudin-1, claudin-5, occludin和Nrf2/ARE通路中Nrf2, HO-1, NQO1蛋白的表达，且claudin-5, occludin, Nrf2, HO-1表达差异有统计学意义(P＜0.05)。天麻酚性成分3#、6#对bEnd.3中claudin-5, occludin, Nrf2, HO-1, NQO1表达无明显影响。2．天麻乙酸乙酯提取部位酚性成分对血脑屏障中星形胶质细胞的保护作用2.1H2O2诱导astrocyte损伤细胞的LDH泄漏率与正常组比，0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM H2O2诱导astrocyte损伤4h，差异有统计学意义(P＜0.01)；0.5mM H2O2诱导astrocyte损伤2h，差异有统计学意义(P＜0.05)，0.5mMH2O2诱导astrocyte损伤4h、6h差异有统计学意义(P＜0.01)。以0.5mM H2O2作用于细胞4h作为H2O2造成astrocyte损伤最佳条件。2.2天麻酚性成分5#的不同浓度(12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml)可降低H2O2诱导astrocyte损伤的LDH泄漏率，差异有统计学意义(P<0.001)。2.3与正常组比，天麻酚性成分5#具有增加正常astrocyte中BDNF, Nrf2,HO-1, NQO1蛋白表达的趋势，50ug/ml可使BDNF表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。在0.25mM H2O2诱导astrocyte损伤1h的条件下，与正常组比，天麻酚性成分5#可增加H2O2诱导的astrocyte星型胶质细胞氧化损伤中Nrf2, HO-1,NQO1表达，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比，50μg/ml可使H2O2诱导的星型胶质细胞氧化损伤中HO-1的表达增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：1．天麻乙酸乙酯提取部位酚性成分5#可保护氧化应激诱导的BBB损伤，其机制可能与增加血管内皮细胞紧密连接蛋白occludin, claudin-1, claudin-5的表达，促进血管内皮细胞的增殖及激活血管内皮细胞和星型胶质细胞Nrf2通路并增加其下游蛋白BDNF, HO-1, NQO1表达有关。2．天麻乙酸乙酯提取部位酚性成分3#、6#、8#对血脑屏障有一定的保护作用，其作用机制可能通过其他通路发挥保护作用，有待进一步研究。3．天麻乙酸乙酯提取部位酚性成分1#、2#、4#、7#初步筛选对BBB无明显保护作用。