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目的:
1.分析甲状腺肿瘤(thyroidtumor,Th)患者线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)基因MTATP6、MTATP8的变异情况。
2.分析MTATP6、MTATP8基因变异与甲状腺肿瘤临床病理资料之间的关系。
3.探讨MTATP6、MTATP8基因变异在甲状腺肿瘤发生发展中的作用。
方法:
1.标本采集:随机收集温州地区80例甲状腺肿瘤患者的冰冻病理切片,及其外周静脉血,其中包括甲状腺恶性肿瘤60例(甲状腺乳头状癌59例和甲状腺滤泡状癌1例)和甲状腺良性肿瘤20例(腺瘤型结节性甲状腺肿1例和甲状腺腺瘤19例),同时采集所有患者的完整临床资料。
2.DNA提取:光学显微镜下观察病理冰冻组织切片,区分肿瘤组织和肿瘤旁正常组织。按酚-氯仿法提取肿瘤组织和肿瘤旁组织的全基因组DNA,用试剂盒法提取血液标本的全基因组DNA。
3.PCR扩增:设计2对相互重叠的引物对线粒体MTATP6、MTATP8基因进行PCR扩增,产物直接进行测序。
4.数据分析:以修正剑桥参考序列(rCRS:NC_012920)为对照,应用生物软件CodoncodeAligner对测序结果MTATP6、MTATP8基因变异情况进行分析;运用生物信息学软件ClustalX进行保守性分析,借助蛋白质数据库对二级结构进行预测,探讨MTATP6、MTATP8基因变异的致瘤分子机制。
5.统计分析:通过统计学方法并结合甲状腺肿瘤患者临床资料,分析MTATP6、MTATP8基因变异与甲状腺肿瘤的关系。
结果:
1.80例甲状腺肿瘤散发患者MTATP6和MTATP8基因片段共发现45个变异位点,这些位点在MTATP6基因(np8527-np9027,681bp)和MTATP8基因(np8366-np8572,207bp)变异发生率分别为5.58×10-2/碱基(38/681bp)、3.38×10-2/碱基(7/207bp)。
2.MTATP6基因变异率在甲状腺恶性肿瘤组和甲状腺良性肿瘤组间存在显著性差异(P=0.048)。MTATP8基因变异率两组间无显著性差异。
3.本实验共在60例甲状腺恶性肿瘤标本中共发现了3个突变位点,其中1个为同质性的突变,2个为异质性的突变;1个为错义突变,2个为同义突变;三个突变位点的类型皆为碱基间的转换。
4.在9128位点发生T-C的突变后,不仅使非极性疏水氨基酸(I)变成了极性中性氨基酸(T),而且使MTATP6亚基由膜外区转变为跨膜区,ATP6亚基的蛋白质二级结构由5个跨膜区变为6个跨膜区。
5.甲状腺恶性肿瘤组和良性肿瘤组多重SNP比较无显著性差异,但在甲状腺肿瘤患者中同时携带A8860G,A8701G变异的发生率比只携带A8860G变异的发生率高,具有显著性统计学意义(P=0.004)。
6.MTATP6和MTATP8基因突变结合甲状腺恶性肿瘤患者临床资料分析发现所有P值均>0.05,认为MTATP6和MTATP8基因突变与甲状腺恶性肿瘤患者临床资料无相关性。
结论:
1.线粒体MTATP6和MTATP8基因存在较多变异,大部分可能为mtDNA多态性位点,但不能排除部分位点提高个体对甲状腺肿瘤的易感性。
2.在本研究样本例数(包括60例恶性和20例良性甲状腺肿瘤)和地域(温州地区)范围内,线粒体MTATP6和MTATP8基因突变在恶性肿瘤组和良性肿瘤组两组间的突变率无统计学差异(P值>0.05),但检测到的错义突变T9128C的二级结构预测能引起蛋白质结构的改变,推测其在甲状腺肿瘤的发生发展中可能起一定作用。
3.携带MTATP6多重SNP:C8414T,A8860G,A8701G或A8860G,A8701G变异的个体可能对甲状腺肿瘤更易感。
4.本研究范围内线粒体MTATP6和MTATP8基因突变与甲状腺肿瘤患者临床资料间无相关性。