前言铝（aluminum）是地壳中含量最丰富的元素之一,大量蓄积可产生神经毒性作用。国内外流行病学调查和研究表明,铝易致神经元损伤,引起智力和认知能力下降等学习和记忆方面的缺陷。目前动物实验已证实,铝暴露可致大鼠痴呆,其不仅表现为学习和记忆的行为障碍,而且其病理形态学改变也与阿尔茨海默病（AD）相似。海马是学习和记忆的关键脑区,海马长时程增强（long-term potentiation,LTP）是NMDA受体依赖性突触传递效能的持续性增强,是公认的脑学习记忆功能在突触水平的研究模型和神经基础。因此研究铝暴露对海马LTP及与其突触机制有关的各项生化指标的影响,有助于从突触和蛋白分子水平阐明铝损害脑学习和记忆功能的作用机制。目前虽然铝对LTP损害作用的观察很多,但其损害作用的突触机制尚未完全阐明。母体期和断乳后发育期是脑发育和逐渐完善的重要阶段,有关此阶段铝对学习和记忆及LTP影响的报道很少,因此我们应该对铝的潜在发育毒性及直接发育毒性给予特别关注。且文献检索显示,铝对NO的直接影响尚未见报道。本实验以出生前后（包括母体期和断乳后发育期）慢性铝暴露为模型,观察铝对母体期脑发育的间接发育毒性和断乳后脑发育期的直接发育毒性所致学习和记忆能力、LTP诱导与维持的改变及对海马细胞内nNOS、NO、Ng的影响,进一步探讨铝对学习与记忆的影响及其突触机制,为铝所致儿童智力和认知能力低下性神经疾病的早期防治提供重要的实验依据。材料与方法1、动物分组与染毒健康Wistar大鼠45只（由中国医科大学实验动物中心提供）,体重300g左右,♀♂2:1。适应饲养环境1 wk后按体重随机分为3组:对照组、低剂量组和高剂量组,每组15只（♀♂2:1）。对照组（control group）:饮用蒸馏水;低剂量组（0.2%-Al group）:饮用含0.2%AlCl₃的蒸馏水溶液;高剂量组（0.4%-Al group）:饮用含0.4%AlCl₃的蒸馏水溶液。各组自染毒始即分别合笼,子代鼠出生后通过母乳继续染毒,出生后21 d断乳,断乳后各组子代鼠对应分别以蒸馏水或母鼠染毒剂量的AlCl₃溶液喂养,至子鼠生后90 d。然后按原母鼠染毒的剂量分组,每窝取1～2只子鼠（♀♂各半）,组成子代各实验组,各项实验每组7～13只,撤毒后以蒸馏水喂养。各组分批交替进行各项测试实验。动物室温度18℃～23℃,相对湿度45%～55%,光照时间12h:12h。2、脑组织及血液中铝含量测定准确称取（0.1～0.5）g的脑组织或准确吸取（0.2-0.5）ml的全血于石英烧杯中,加（5～8）ml混酸,同时做空白对照。采用原子吸收石墨炉法测定脑铝和血铝含量。3、学习与记忆的行为学测定测试方法为跳台法（即步下试验）。学习行为训练:将大鼠放入跳台仪内适应3 min后训练其找到平台三次,大鼠跳下平台时,立即通电给予持续电刺激（36 V）并开始计时,记录5 min内大鼠受到电刺激第一次跳上平台躲避电击的反应时间（escape latency,EL）以及受到电击的次数（number of errors）。24 h后进行记忆保持测试:记录大鼠置于平台到第1次跳下平台的时间（step-down latency,SDL）和5 min内受到电击的次数（错误次数）。4、电生理LTP测定乌拉坦麻醉后,将动物头部固定于脑立体定位仪上,暴露颅骨。将双极刺激电极插入右侧海马CA3区锥体细胞发出的Schaffer侧枝部位（坐标:前囟后3.3mm;旁开3.8 mm;皮层下3.8 mm）,将内充3 mol/L的记录玻璃微电极插入海马CA1区部位（坐标:前囟后3.3 mm;旁开1.5 mm;电极尖端抵皮层表面）,然后逐步推进行细胞外记录。先找到稳定的群体锋电位（population spike,PS）后,首先记录30 min每分钟单脉冲刺激所诱发的PS。然后观察给予同样强度及波宽的的短串高频条件刺激（100 HZ、持续5s）后,记录45 min每分钟给一个单脉冲检验刺激所诱发的PS的幅值变化。5、nNOS表达的测定电生理测试后的大鼠,4%多聚甲醛固定液心脏灌流固定。常规石蜡切片制作,用免疫组织化学的方法测定海马nNOS表达。用Metamorph/Evolution/BX51显微图像分析系统进行图像分析。6、NO含量的测定采用硝酸还原酶法。电生理测试后的大鼠,迅速断头取脑,在冰盘上快速剖取海马,电子天平准确称重后加入9倍冷生理盐水,按试剂盒说明进行操作。7、Ng表达的测定电生理测试后的大鼠,迅速断头取脑,在冰盘上快速剖取海马,按体积比为1:6～1:9放到预冷的裂解缓冲液中。4℃超声粉碎后12 000 r/min离心1 h,取上清分装。按照常规Western blot方法分离蛋白质。将蛋白印迹显影图扫描,再利用ChemiImager 5500 V 2103图像分析软件对实验结果（测定目标带灰度值）进行分析。8、海马形态学超微结构观察取大鼠海马用常规透射电镜观察出生前后慢性铝暴露情况下年轻大鼠的神经细胞的形态变化。9、统计学处理实验所得数据资料用（?）±s表示,组间资料统计用（SPSS软件）单因素方差分析（ANOVA）检验,行为学数据不服从正态分布,采用秩和检验。实验结果1、各组大鼠血铝和脑铝含量的比较随着铝暴露剂量的升高,铝暴露组大鼠的血铝、脑铝含量逐渐升高,且均显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）,两铝暴露组间差异也显著（P＜0.05）。2、各组大鼠学习和记忆行为学的改变与对照组相比,两铝暴露组大鼠第一次跳上平台的时间（反应时间）均明显延长（P＜0.01）,跳下平台的潜伏期明显缩短（P＜0.01）,5 min内错误次数显著增加（P＜0.01）,且两铝暴露组间亦有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。3、各组大鼠PS幅值变化（即LTP增强率）的比较随着铝暴露剂量的升高,高频刺激后PS幅值增强率依次降低,两铝暴露组与对照组相比,显著降低（P＜0.01）,但两暴露组之间差异不显著。4、各组大鼠海马nNOS表达的变化与对照组相比,各铝暴露组海马CA1、CA3区nNOS表达均显著减少,且两暴露组组间也有极显著性差异（P＜0.01）。5、各组大鼠海马细胞内NO含量的变化随着铝暴露剂量的升高,大鼠海马细胞内NO含量依次降低。两铝暴露组均明显低于对照组（P＜0.01）,且两暴露组间也有极显著性差异（P＜0.01）。6、各组大鼠海马细胞内Ng表达的变化随着染铝浓度的增加,Ng表达量降低。与对照组相比,各染毒组海马胞内Ng含量均显著降低,但两铝暴露组组间差异不显著。7、各组大鼠海马形态学超微结构观察与对照组相比,两铝暴露组海马神经元受到损伤,细胞膜和细胞质溶解,核破损,细胞器破坏。讨论母体期和断乳后发育期脑的功能受损的研究是一个关系到婴幼儿智力健康发育的重要问题,同时,研究铝对此阶段脑发育的影响及其机制,对预防铝所致神经性疾病有着重要意义。本实验观察到,出生前后慢性铝暴露（孕期、哺乳期和断乳后发育期）的各组年轻大鼠脑铝及血铝含量均显著升高。与对照组相比,两铝暴露组的学习和记忆能力及LTP诱导与维持均明显下降,表明出生前后的铝暴露,可通过胎盘和血脑屏障进入子代大鼠体内,造成铝在子代体内蓄积,特别是脑内的蓄积,进而损害了子代鼠的学习和记忆能力。本实验还观察到,各组海马细胞内nNOS、Ng表达及NO含量也明显降低,提示,出生前后连续慢性铝暴露年轻大鼠学习记忆能力减退的可能原因之一是铝干扰了nNOS的表达,进一步抑制了NO的生成。另一原因可能是铝抑制了Ng的表达。就我们所涉猎的文献显示,铝可干扰谷氨酸能神经传递、NMDA受体相关的信号转导途径,铝可抑制参与胞内钙信号调节的多种分子途径,铝可降低小脑内钙调蛋白（CaM）的含量,铝还可使胆碱能和去甲肾上腺素能神经传递发生改变。可见,铝损伤了LTP诱导中的一系列环节,使Glu、NMDA受体、Ca²⁺与CaM均减少,必然影响其下游过程。Ca²⁺/CaM可激活nNOS,铝可抑制nNOS的表达,也可通过降低Ca²⁺浓度及CaM使nNOS激活减少,从而使NO生成减少。此外,Ng是CaM的储库,铝可抑制Ng的表达。通过上述途径导致LTP的诱导和维持受阻,致使大鼠学习和记忆能力下降。铝能够引起线粒体和DNA的损伤进而导致神经元细胞的损伤和凋亡。总之,铝可损害LTP诱导中的多种突触机制,从而损害大鼠的学习和记忆能力。结论（1）出生前后慢性铝暴露使大鼠学习测试的反应时间显著延长,记忆测试的潜伏期明显缩短,5 min错误次数均显著增加,提示铝暴露损害了大鼠的学习和记忆行为。（2）出生前后慢性铝暴露使PS幅值增强率减小,提示该暴露损害了大鼠LTP的诱导与维持。（3）出生前后慢性铝暴露使海马细胞内nNOS表达减少,进而使NO含量显著降低,提示这可能是铝损害LTP的另一突触机制。（4）出生前后慢性铝暴露使海马细胞内Ng表达减少,可能是铝损害LTP的机制之一。（5）出生前后慢性铝暴露使脑组织的结构和细胞形态发生改变,提示铝损害了细胞功能状态可能是铝损害学习记忆的机制之一。