遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)是一种常染色体显性遗传性恶性肿瘤综合征，外显率高达80％～90％，占所有结直肠癌的2％～15％。HNPCC与散发性结直肠癌相比，在发病机制上、临床表现上以及治疗方案的选择和随访方案的制定上均不尽相同，将两者区分开来不仅具有实际的临床意义，而且有利于遗传学咨询，其已被许多国家重视，欧美发达国家、韩国、日本等成立了完善的登记和分析机构，并进行了深入的分子遗传学研究。为了在国际间更好地研究HNPCC，1989年成立了HNPCC国际合作小组(International Collaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer，ICG-HNPCC)。自1990年以来，Amsterdam标准(Ⅰ、Ⅱ)、日本标准、Bethesda指导纲要等筛选HNPCC家系的临床标准相继被提出。然而，HNPCC的确诊有赖于错配修复(mismatch repair，MMR)基因的胚系病理性突变的检出。大量的研究资料表明，在世界范围内与HNPCC相关的MMR基因突变位点分布广泛，缺少突变热点。我国人群MMR基因的突变谱系如何?有相关突变热点吗?相关的报道甚少。结直肠癌已是我国最常见的恶性肿瘤之一，并有逐年上升的趋势，目前已成为女性第二位、男性第三位高发恶性肿瘤，再之，我国是一个实行计划生育的国家，家系的正变得越来越小，HNPCC的家族倾向变得也越来越不明显，所以在我国进行该领域的系统研究必要而紧迫。本研究共分以下三部分，分别报告如下：第一部分基于外周血mRNA的MLH1和MSH2基因胚系突变检测目的：1．在国内建立一种利用耐热性逆转录酶和特异引物、基于外周血mRNA异常诊断HNPCC家系方法；2．探讨中国人群HNPCC家系的MLH1和MSH2基因胚系突变类型和谱系。方法：收集符合Amsterdam标准(包括Ⅰ、Ⅱ)家系19个、日本标准11个、Bethesda指导纲要29个共109个家系成员外周血标本，提取mRNA和DNA；利用耐热性逆转录酶和MLH1、MSH2特异引物，特异地逆转录该两基因的mRNA；PCR扩增逆转录产物(cDNA)；测序分析PCR产物；利用基于基因组DNA的扩增测序，验证基于mRNA扩增测序检出的部分新突变。结果：在59个HNPCC的临床家系中，17个家系被检出MLH1和MSH2胚系突变，家系的总突变率为28.8％，分布于15个位点上，其中9个MLH1突变(60％，9／15)，6个MSH2突变(40％，6／15)。6个是已报道的病理性突变，9个是尚未报道的新突变。突变的类型包括错义突变(10个)、终止密码子突变(1个)、移码突变(1个)、同义突变(2个)和非编码区突变(1个)。MLH1的突变分别分布于外显子2(2个)、8(1个)、12(2个)、16(2个)、4(1个)和外显子19(1个)，其中两家系的突变位于12外显子的同一位点上。MSH2的突变分别分布于外显子1(1个)、2(1个)、3(1个)、7(1个)、12(1个)和外显子13(1个)，其中两家系的突变位于3外显子的同一位点上。结论：1．基于外周血mRNA的基因测序方法能检测出MMR基因的胚系突变，与基于基因组DNA测序方法相比，成本较低。2．MLH1基因的胚系突变率略高于MSH2者。3．在中国人群中，与HNPCC相关的MMR基因胚系突变类型可能以错义突变为主。4．Amsterdam标准对HNPCC预示的阳性率高于日本标准；日本标准对HNPCC预示的阳性率高于Bethesda指导纲要。5．MLH1基因的第2、12、16外显子和MSH2基因的第3外显子可能是中国人群的高突变外显子。第二部分MLH1和MSH2胚系新错义突变功能性的初步评价目的：1．评价2个MLH1新错义突变和3个MSH2新错义突变的功能性。2．判断有新错义突变的家系是否是HNPCC家系。方法：整理新突变家系的患病谱系，收集新突变患者肿瘤组织，使用一组国际HNPCC合作小组推荐的5个微卫星位点，包括单核苷重复序列BAT25、BAT26和双核苷重复序列D2S123、D5S346和D17S250，PCR扩增产物经ABI 310 DNA自动分析仪检测，以各患者外周血标本作为内对照，利用Genescan软件分析判断微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)状态。利用Envision免疫组化(immunohistiochemistry，IHC)法检测MLH1和MSH2蛋白的表达情况；以肿瘤组织间质细胞和浸润的淋巴细胞为对照。将MSI、IHC结果和各患者家系的临床资料相结合，综合评价各突变的功能性。结果：1．家系资料：本研究6家系共有患者20人，平均初发最年轻年龄为36.7岁，有多原发癌者3人，右半结肠癌8个(44.4％，8／18)，左半结肠癌10个(63.6％，10／18)。2．MSI检测结果：在检测的6个家系患者中，1个患者的肿瘤组织在全部5个微卫星点上出现新生峰，3个患者的肿瘤组织分别有4个微卫星点出现新生峰，2个患者的肿瘤组织分别在3个微卫星点上出现新生峰；在5个微卫星点上，6个患者的外周血对照DNA均未出现新生峰。根据微卫星不稳定性的判断标准，该6个患者的肿瘤组织均呈高度微卫星不稳定性。3．IHC检测结果：在检测的6患者肿瘤组织中，癌旁的腺体、间质纤维细胞、浸润的淋巴细胞等非肿瘤成分均呈MLH1和MSH2蛋白染色阳性。两蛋白在癌旁腺体的表达主要定位于腺窝以下的腺上皮的细胞核上。间质的纤维细胞和浸润的淋巴细胞较弥漫的核阳性。有MLH1突变的2患者MLH1蛋白1个患者失表达，另1患者弱表达，而MSH2蛋白表达正常。有MSH2突变的4患者MSH2蛋白均失表达，而MLH1蛋白表达正常。MLH1、MSH2基因突变与其蛋白异常表达符合率均为100％(6／6)。结论：6家系的5个突变均有功能改变，为病理性，即：MLH1第12外显子、412密码子缬氨酸→甘氨酸突变、第16外显子、581密码子的脯氨酸→亮氨酸突变以及MSH2第3外显子、127密码子的天冬酰氨→组氨酸突变、第7外显子、367密码子的缬氨酸→甘氨酸突变和第13外显子、646密码子的苏氨酸→精氨酸突变均为病理性。该6家系均为HNPCC家系。第三部分HNPCC临床家系外周血MLH1基因mRNA的定量分析目的：1．探讨符合不同标准的HNPCC临床家系外周血MLH1基因mRNA量的表达情况。2．建立一种基于外周血新的分子筛选HNPCC家系的方法。方法：1．标本准备：收集与本研究第一部分相同家系成员的外周血标本，提取各成员的总RNA。2．逆转录：利用耐热性逆转录酶和随机引物，逆转录各成员的RNA。3．利用MLH1 TaqMan荧光探针和特异引物进行实时荧光定量PCR扩增逆转录产物(cDNA)；以保守基因TAMRA作为对照；荧光定量检测结果采用opticonmonitor 1.07软件进行分析。4．将每一标本所得MLH1基因拷贝数与其相对应的HBA2基因拷贝数相除来校正不同标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异，得出MLH1基因相对表达量；比较符合不同HNPCC临床家系MLH1基因mRNA的表达差异；在符合Amsterdam标准家系间，比较有突变和无突变家系MLH1基因mRNA的表达差异。结果：1．各成员MLH1基因的mRNA的相对表达量用MLH1／HBA2×10~5表示。在符合Amsterdam标准的家系中MLH1基因的mRNA相对表达量为2.98×10~6～64.32，平均值为10.91；在符合日本标准的家系中相对表达量为7.14×10~3～13.56，平均值为1.74；在符合Bethesda指导纲要的家系中相对表达量为6.25×10~3～44.14，平均值为4.17。2．在符合Amsterdam标准的临床家系，有突变和无突变成员的MLH1基因mRNA相对表达量有显著性差异(P＜0.001)；在Amsterdam标准和日本标准的家系、Bethesda指导纲要间以及日本标准和Bethesda指导纲要间MLH1的mRNA相对表达量均无显著性差异(P＞0.05)。结论：1．TaqMan实时荧光定量PCR技术能用于MLH1基因的mRNA定量分析。2．在有突变的成员和无突变的成员间，MLH1基因的mRNA表达量很可能存在着显著性差异。3．在符合Amsterdam标准、日本标准和Bethesda指导纲要家系间，MLH1基因的mRNA的表达量很可能没有显著性差异。