女性绝经后因为雌激素缺乏,导致动脉粥样硬化风险明显上升。随着人口老龄化的发生,绝经后动脉粥样硬化已成为威胁老年女性健康的重大公共卫生问题之一。“脉络学说”和“气络学说”是络病理论的两大学科分支,脉络学说主要研究心脑血管疾病为代表的脉络病变,气络学说主要研究神经、内分泌、免疫类疾病为代表的气络病变。动脉粥样硬化属于典型的脉络病变,而绝经后女性以雌激素水平降低为代表的性激素功能紊乱则与气络病变相关,因此“绝经后动脉粥样硬化”属于“气络-脉络”共患疾病。目前以络病理论指导该病防治未见报道,络病理论指导下“络虚通补”代表性药物八子补肾胶囊具有填补肾精、燮理阴阳之功,且文献研究显示其药味中含有植物雌激素,因此,从脉络学说、气络学说分别探讨该病病机与治法,开展八子补肾胶囊防治该病的物质基础及作用机制研究具有重要意义。目的:本课题分别从中医络病理论和基础实验两个层面进行研究,理论部分基于该病属于“气络-脉络”共患病,从气络、脉络功能切入探讨该病中医病机、治法及组方,揭示络病理论对绝经后动脉粥样硬化的防治指导价值。实验部分通过建立绝经后动脉粥样小鼠模型及炎症致内皮细胞损伤模型,从整体动物、组织器官、分子等不同水平探讨八子补肾胶囊治疗绝经后动脉粥样硬化药效作用,重点围绕对雌激素膜受体、炎症、凋亡等方面探讨其作用机制,通过本课题为络病理论指导该病防治提供理论及实验数据支持。方法:1.理论探讨:本课题通过系统梳理气络、脉络、气血相关、肾精及补肾填精法的理论文献,从络病理论气血相关的角度探讨绝经后动脉粥样硬化属于“气络-脉络”共患疾病,从气络络属调节、自稳调控功能紊乱,脉络渗灌气血、濡养代谢功能异常角度切入,探讨该病中医病机、治法及组方,为络病理论指导绝经后动脉粥样硬化的防治提供理论依据。2.实验研究:实验一:应用Waters H-class UPLC色谱分析仪,紫外检测器,对八子补肾胶囊的指纹图谱进行实验研究。色谱条件:色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm,2.1*100mm;设置如下参数为初始条件,流速:0.3mL/min;波长:全波长扫描;柱温:30℃;进样体积:1μL;流动相:乙腈—酸水(0.1%磷酸水溶液)。样品处理方法:筛选含量较高的对照品可指认的优势成分,以其峰面积加和为指标,通过正交实验优化提取条件确定提取次数、提取溶剂、超声时长、溶剂体积。6-8周龄SPF级雌性C57BL/6J和雌性ApoE-/-小鼠(体重18～22g),适应性喂养3天后,所有ApoE-/-小鼠行双侧卵巢切除术(Ovx),C57BL/6J小鼠行假手术,术后恢复期7天,待体内残留雌激素消除后,将造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组,每组15只,即模型组(Model)、阳性对照组(G1)、八子补肾高剂量组(HD-BZ)和八子补肾低剂量组(LD-BZ);C57BL/6小鼠作为对照组(Control)。对照组给予标准饲料喂养,其他组给予不含雌激素的高脂饲料喂养。G1组皮下注射G1 0.2 μg/d,八子补肾组每日给予八子补肾灌胃(HD-BZ组2.8g/kg/d、LD-BZ组1.4g/kg/d),对照组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃。每日给药1次,连续12周。实验结束后,称量小鼠体重,处死小鼠,收集各组小鼠的血清、主动脉根部、主动脉弓、胸腹主动脉全程及子宫,检测相关指标。①称量各组小鼠的体重以及子宫重量,计算子宫萎缩指数。②采用放射免疫法检测各组小鼠血清雌二醇(E2)的含量。③采用代谢组学技术检测各组小鼠血清代谢产物的变化。④采用全自动生化分析仪检测小鼠血脂水平。⑤采用油红O染色技术观察各组小鼠胸腹主动脉的动脉粥样硬化斑块形成情况。⑥采用H&E染色和油红O染色技术观察各组小鼠主动脉根部的脂质沉积。实验二:动物实验部分:6-8周龄SPF级雌性C57BL/6J和雌性ApoE-/-小鼠(体重18～22g),适应性喂养3天后,所有ApoE-/-小鼠行双侧卵巢切除术(Ovx),C57BL/6J小鼠行假手术,术后恢复期7天,待体内残留雌激素消除后,将造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组,每组15只,即模型组(Model)、阳性对照组(GI)、八子补肾高剂量组(HD-BZ)和八子补肾低剂量组(LD-BZ);C57BL/6小鼠作为对照组(Control)。对照组给予标准饲料喂养,其他组给予不含雌激素的高脂饲料喂养。G1组皮下注射G1 0.2 μg/d,八子补肾组每日给予八子补肾灌胃(HD-BZ组2.8g/kg/d、LD-BZ组1.4g/kg/d),对照组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃。每日给药1次,连续12周。实验结束后,处死小鼠,收集各组小鼠血清、主动脉弓、胸主动脉及腹主动脉全程,检测炎症及凋亡形态学变化及相关分子生物学指标。①采用免疫荧光法观察各组小鼠主动脉弓动脉粥样硬化病变区域的炎症细胞聚集。②采用TUNEL凋亡检测各组小鼠血管动脉粥样硬化斑块中内皮细胞凋亡。③采用ELISA法检测各组小鼠血清粘附因子VCAM-1和ICAM-1分泌水平。④采用qRT-PCR法检测各组小鼠主动脉VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及Bax基因的表达。⑤采用Western blot法检测各组小鼠主动脉炎症相关蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、VCAM-1、ICAM-1 及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase3 及 caspase3 的表达。细胞实验部分:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)构建内皮细胞损伤模型。实验随机分为5组:即正常组(Control):无血清培养基,模型组(Model):无血清培养基+Ox-LDL、阳性对照组(G1):G1(预给药4h)+无血清培养基+Ox-LDL、八子补肾高剂量组(HD-BZ):HD-BZ(预给药4h)+无血清培养基+Ox-LDL和八子补肾低剂量组(LD-BZ):LD-BZ(预给药4h)+无血清培养基+Ox-LDL。①采用MTS方法检测各组细胞生存活性变化,确定造模条件及G1、HD-BZ和LD-BZ剂量。②采用ELISA法检测各组细胞上清液中VCAM-1和ICAM-1含量。③采用流式细胞术检测各组HUVECs的凋亡率。④采用qRT-PCR技术检测各组细胞VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及Bax基因的表达水平。⑤采用Western blot技术检测各组HUVECs的炎症相关蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、VCAM-1、ICAM-1 及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase3及caspase3的表达。实验三:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),利用瞬时转染技术构建GPER1基因沉默内皮细胞模型。细胞随机分为6组:即空转对照组(siNC-Control)、空转模型组(siNC-Model)、空转八子补肾组(siNC-BZBS)、GPER1 基因沉默对照组(siGPER I-Control)、GPER1基因沉默模型组(siGPERl-Model)、GPER1基因沉默八子补肾组(siGPER1-BZBS)。①利用荧光显微镜下观察红色荧光物质的表达及Western blot技术鉴定GPER1沉默效率。②采用ELISA法检测各组细胞上清液中VCAM-1和ICAM-1含量。③采用流式细胞术检测各组转染细胞的凋亡率。④采用TUNEL凋亡检测各组转染细胞的凋亡率。⑤利用Western blot技术检测各组转染细胞炎症相关蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、VCAM-1、ICAM-1及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase3 及 caspase3 的表达。结果:1.理论研究:①气络学说与脉络学说相结合是指导绝经后动脉粥样硬化的新理论学说。②肾精亏虚所致元气虚乏、宗气不足以贯心脉、营卫失和,引起气机气化异常导致络气虚滞,脉络瘀阻是老年女性脉络损伤的重要病机,补精化气是治疗绝经后动脉粥样硬化的主要治法。③八子补肾胶囊具有补肾填精、燮理阴阳之功,为绝经后动脉粥样硬化的临床预防和治疗提供了新的治疗手段。2.实验研究:实验一:①超高效液相色谱(Ultra high performance liquid chromatography,UPLS)指纹图谱鉴定出八子补肾胶囊含有14种化合物,分别是:新绿原酸(neochlorogenic acid)、绿原酸(chlorogenic acid)、隐绿原酸(cryptochlorogenic acid)、异槲皮苷(isoquercitrin,ISO)、金丝桃苷(Hyperoside,Hyp)、毛蕊花糖苷(verbascoside,VB)、朝藿定 A(epimedin A)、淫羊藿苷(icariin,ICA)、宝藿苷 I(baohuoside I)、欧前胡素(imperatorin,IMP)、蛇床子素(osthole,Ost)、梓醇(catalpol,CP)、五味子甲素(deoxyschizandrin)、五味子乙素(schisandrin B)。其中,除了新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸,另外11种均为PEs。②子宫萎缩指数结果显示,G1及BZBS均无明显刺激子宫增生作用。③血清E2结果显示,与Model组相比,G1组E2水平无明显变化,而HD-BZ组及LD-BZ组的E2浓度均上升。④血清代谢组学结果显示:OPLS-DA模型成功区分了各组,并揭示了 BZBS具有一定的治疗作用。鉴定出含量最高的4种化合物中,G1和BZBS能提高血清二十二碳六烯酸、3-羟基丁酸和5(Z)、8(Z)、11(Z)-二十碳三烯酸的含量,并降低溶血磷脂酰乙醇胺(18:0)含量。⑤血生化结果显示,与Model组相比,G1和BZBS可以明显降低血清TC、TG、LDL-C水平,同时提高HDL-C水平。⑥主动脉大体油红O染色显示:G1和BZBS能减少动脉粥样硬化斑块形成。⑦主动脉弓H&E染色和主动脉根部油红O染色结果显示:G1和BZBS能减少主动脉根部及主动脉弓的脂质沉积。实验二:动物实验部分:①免疫荧光结果显示:G1和BZBS能减少小鼠主动脉弓动脉粥样硬化病变区域的炎症细胞聚集。②TUNEL凋亡结果显示:G1和BZBS能减少小鼠血管动脉粥样硬化斑块内皮细胞凋亡。③ELISA结果显示:G1和BZBS能降低小鼠血清粘附因子VCAM-1和ICAM-1分泌水平。④qRT-PCR结果显示:G1和BZBS能使小鼠主动脉VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及B3x mRNA的表达减少。⑤Western blot结果显示:G1和BZBS 抑制 了小鼠主动脉 IκBα及 NFκB p65 磷酸化,使 p-IKBα/IκBα及 p-NFκB p65/NFκB p65比值降低,进而抑制下游VCAM-1、ICAM-1的表达;G1和BZBS还能上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase3的表达。细胞实验部分:(①MTS方法结果显示:Ox-LDL120μg/mL为造模浓度,G1 10nmol/L、HD-BZ 400μg/mL和LD-BZ 100μg/mL为后续实验浓度。②ELISA结果显示:G1和BZBS能降低细胞上清液中VCAM-1和ICAM-1含量。③流式细胞术结果显示:G1和BZBS降低细胞凋亡率。④qRT-PCR结果显示:G1和BZBS降低细胞VCAM-1、ICAM-1、Bcl-2及Bax mRNA的表达水平。⑤Western blot结果显示:G1和BZBS抑制NF-κB通路,降低 p-IκBα/IκBα及 p-NFκB p65/NFκB p65 比值,并抑制 VCAM-1、ICAM-1 的表达,还能上调Bcl-2水平,下调Bax水平及抑制caspase3的剪切和活化。实验三:①荧光显微镜下观察可见:细胞转染率达80%以上;Western Blot结果显示:与空转对照组相比,成功转染的细胞GPER1表达明显降低。②ELISA结果显示:siNC-Model组和siGPERl-Model组VCAM-1和ICAM-1蛋白含量明显上升,siGPER1-Model组更显著。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显著抑制粘附分子表达;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抑制粘附分子表达的作用减弱。③流式细胞术结果显示:siNC-Model组和siGPER1-Model组凋亡率明显上升,siGPER1-Model组更显著。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显著抑制凋亡;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抗凋亡作用减弱。④TUNEL凋亡结果显示:siNC-Model组和siGPER1-Model组凋亡率明显上升,siGPER1-Model组更显著。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显著抑制凋亡;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抗凋亡作用减弱。⑤Western blot结果显示:siNC-Model 组和 siGPER1-Model组,NF-κB 信号通路相关蛋白(p-IκBα/IκBα、p-p65/p65)及下游VCAM-1和ICAM-1的表达均明显上调,siGPER1-Model组更显著。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组炎症相关蛋白表达水平明显下降;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组对炎症的抑制作用明显减弱。siNC-Model组和siGPER1-Model组,Bcl-2水平明显降低,而Bax及cleaved-caspase3的表达明显上升,siGPER1-Model组更显著。与siNC-Model组比较,siNC-BZBS组显著抑制凋亡;与siGPER1-Model组比较,siGPER1-BZBS组的抗凋亡作用明显减弱。结论:1.首次以络病理论指导绝经后动脉粥样硬化防治,基于气血相关的络病理论特色认为绝经后动脉粥样硬化属于“气络-脉络”共患病,提出肾精亏虚、络气虚滞、脉络瘀阻为该病主要病机,确立补精化气治法,八子补肾胶囊具有补肾填精、燮理阴阳的作用,成为防治绝经后动脉粥样硬化的有效药物。2.实验证实,八子补肾胶囊补精化气,补充植物雌激素,激活雌激素受体,系统调节血清代谢物谱紊乱,阻断血管炎症反应;调节脉络渗灌气血、濡养代谢功能,减轻炎症介导的血管内皮细胞凋亡,抑制动脉粥样硬化斑块形成,为八子补肾胶囊治疗绝经后动脉粥样硬化提供实验支持。