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龋病仍然是影响人类健康的常见病。有资料显示,目前我国的患龋率达50%以上。提高口腔中唾液抗致龋菌变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)的特异抗体水平,是防治龋病的有效途径。免疫防龋研究在上个世纪七十年代就已开始,迄今已有较多的报道。然而,迄今为止的研究结果显示：接种防龋疫苗诱导产生的特异性抗体在口腔唾液中水平升高并不十分显著,对龋病的免疫保护效果仍不太理想。研究表明,通过某粘膜途径接种疫苗产生的特异IgA抗原递呈细胞(IgA+ASCs)可迁徙至呼吸道、胃肠道及外分泌腺(如涎腺)的固有层。目前已经清楚,口服抗原在肠道被抗原递呈细胞捕获处理后运送到派伊尔氏结(Peyer’s pat ch,PP)等粘膜相关淋巴组织(粘膜免疫诱导组织),激活抗原特异性免疫细胞,产生免疫应答。其中致敏的部分B细胞经转向重组(class switch recombination,CSR)后,分化为抗原特异IgA+ASCs,随后,经血循环迁徙至粘膜免疫效应部位(其中包括涎腺),产生并分泌IgA,发挥免疫保护效应。趋化性细胞因子CCL28在引导IgA+ASCs经血循环选择性地向某些粘膜免疫效应部位归巢的过程中起关键作用。涎腺上皮细胞表达分泌至涎腺腺泡间组织中的CCL28可通过某种机制转运到局部毛细血管后静脉内皮细胞游离面,通过与IgA+ASCs表面的趋化性细胞因子受体CCR10特异结合来启动IgA+ASCs出血管机制,引导IgA+ASCs迁徙归巢至涎腺。此外,CCL28分子的羧基末端去富含组氨酸,可与G-、G+细菌以及某些真菌结合,改变其细胞壁包膜的通透性,具有较强的杀灭细菌、真菌的能力。可见,CCL28在口腔防御中发挥着重要作用。变形链球菌与龋齿的发生和发展有关。其最初与附着作用有关的AgI/Ⅱ功能结构域位于分子的N-末端1/3,此区为唾液结合区段(Saliva-binding region, SBR),含有富含丙氨酸的重复区,是与牙面唾液蛋白受体结合的活性部位,并且证实它在变形链球菌与唾液包被的牙齿表面的最初结合过程中及其随后的龋病发生过程中起重要的作用。由于SBR在变形链球菌致龋过程中发挥重要的作用使其成为防治龋病的主要研究对象。在本研究中,我们构建了一个编码基因CCL28的真核表达质粒,将该重组质粒逆行灌注到大鼠涎腺,检测其免疫效果。我们在前期的研究工作中已经成功构建了一个双启动子真核表达质粒pCN-SSIE,并证明了它作为DNA疫苗的免疫原性。以前期的研究工作为基础,我们采取将pCN-SSIE灌胃和向大鼠涎腺逆行灌注编码基因CCL28的重组质粒联合应用的方法免疫大鼠,并检测联合免疫后的免疫效果,探讨了提高唾液中IgA和CCL28水平的方法,以期为增强防龋疫苗的免疫应答提供新的思路。材料和方法：第一部分：本实验通过PCR方法扩增人CCL28的基因片段,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-8上,经酶切鉴定和测序,检验重组质粒pCMV-3Tag-8-CCL28。将重组质粒转染293细胞,通过western blot方法检测转染后细胞上清中CCL28蛋白的表达。变形链球菌UA159(S. mutans UA159)在37℃、厌氧培养至生长对数期后,在新鲜的BHI培养液或293条件培养中悬浮,调节细菌浓度为1×106CFU/ml,荧光显微镜下观察S.mutans UA159的活性。依次向无菌水中加入质粒DNA和氯化锌,调节它们的浓度,分别为175μg/ml pCMV-3Tag-8-CCL28和3.6mMZn2+,制备zinc/pDNA溶液。通过大鼠腮腺导管逆行灌注zinc/pDNA溶液,分别在免疫后的第0、2、7和14天提取大鼠腮腺和唾液标本。通过RT-PCR方法和免疫荧光分别检测腮腺中CCL28和SIgA的水平,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测唾液中CCL28和SIgA的表达水平。制备S. mutansUA159菌体悬浮液,接种到无菌雄性大鼠,然后将氯化锌溶液、pCMV-3Tag-8和zinc/pCMV-3Tag-8-CCL28对大鼠腮腺逆行灌注,建立动物模型。1周后,收集菌斑,用实时定量PCR方法检测变形链球菌。第二部分：用CaCl：法将提纯的质粒pCN-SSIE转化到减毒沙门氏菌(attenuated salmonella),调节细菌浓度至1010/ml。经胃灌注pCN-SSIE防龋疫苗,3周后,在大鼠腮腺导管逆行灌注重组质粒pCMV-3Tag-8-CCL28,定期检测腮腺中CCL28的水平,以及唾液中CCL28和SIgA的表达水平；定期检查小肠黏膜组织和腮腺中CCR10的表达。结果：第一部分：我们成功构建了含CCL28的真核表达质粒pCMV-3Tag-8-CCL28。体外实验证明该质粒能在真核细胞中分泌CCL28蛋白,具有杀菌抑菌能力。将质粒通过腮腺导管逆行灌注到腮腺,结果显示它能有效地提高腮腺和唾液中CCL28的表达,提高唾液中SIgA的含量；定菌鼠唾液中的变形链球菌数目显著减少。第二部分：联合免疫后1周,腮腺和唾液中CCL28的表达,以及唾液中SIgA的含量显著提高；小肠黏膜组织及腮腺中的CCR10的表达水平增高。结论：1.编码CCL28基因的真核表达质粒成功构建。体内外实验证实,构建的含CCL28基因的真核表达质粒能在真核细胞中分泌CCL28蛋白,具有抑菌杀菌的能力。用其进行涎腺导管逆行灌注转染涎腺细胞,提高了涎腺实体组织中CCL28表达水平。2.用被pCN-SSIE转化的减毒沙门菌对大鼠灌胃进行粘膜免疫接种的同时,在腮腺导管腮腺导管逆行灌注质粒pCMV-3Tag-8-CCL28,发现无论是腮腺中的CCL28,还是唾液中特异性抗SBR SIgA分泌水平均显著提高；涎腺中CCR10的表达也增高。这说明通过在涎腺内进行基因转移,能吸引循环中更多的IgA+ASCs趋化到涎腺,分泌SIgA,因而能上调防龋疫苗诱导的免疫应答,二者在诱导机体粘膜免疫应答时具有协同作用。