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鸡球虫病是鸡的一种最为常见且难以防治的重要寄生虫病,给养鸡业带来严重危害,柔嫰艾美耳球虫(Eimeria tenella)是鸡球虫中致病力最强,造成的危害及损失最为严重的寄生虫。长期以来,鸡球虫病主要依靠化学药物进行防治,而长时间使用化学药物防治鸡球虫病使得耐药性问题凸显,导致化学药物在临床应用上受到极大限制,因此研制新型高效的蛋白疫苗对养鸡业至关重要。近年来,用于防治鸡球虫病的基因工程疫苗和核酸疫苗等各类疫苗引起了国内外学者的高度关注。巴斯德毕赤酵母表达系统是一个近年来被广为利用的真核表达系统,具有基因操作简单、生长速度快、蛋白表达量高、成本低廉以及表达产物较易于纯化等优点,同时该系统还具有蛋白翻译后的修饰作用,如糖基化修饰和蛋白磷酸化功能等特点。SO7基因为柔嫩艾美尔球虫表面抗原基因,该基因构建的疫苗能产生免疫保护效果。NA4基因与TA4基因有较高的同源性,推测出两种基因具有相似的抗原,能够刺激鸡体内产生免疫保护性。白细胞介素2(IL-2)能够促进T细胞和B细胞的增殖分化,在免疫反应过程中起重要调节作用。为研究鸡柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)重组酵母表达蛋白并检测其免疫保护性。将SO7、NA4基因分别与鸡IL-2基因串联,连接至pPICZαA载体中,构建了重组质粒pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2,分别以全菌破碎和诱导表达两种方法提取蛋白并免疫鸡只,进行抗柔嫩艾美耳球虫免疫保护效果评价。旨在为柔嫩艾美尔球虫蛋白疫苗的研究提供试验依据。研究内容如下:(1)pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2重组蛋白的表达及鉴定:利用PCR法扩增SO7基因、NA4基因与鸡IL-2基因,通过linker将SO7基因及NA4基因分别与IL-2基因串联,将获得的SO7-IL-2、NA4-IL-2连接至pMD18-T克隆载体,构建pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2表达载体。经双酶切和测序鉴定重组质粒,利用甲醇诱导表达目的蛋白,经Western blot进行验证分析。并以pPICZαA-SO7、pPICZαA-NA4和pPICZαA-IL-2蛋白。结果表明,SO7基因、NA4基因、IL-2基因大小分别为657 bp、252 bp、468 bp。双酶切和测序鉴定结果表明成功构建了重组质粒pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2。Western blot结果显示重组蛋白pPICZαA-SO7-IL2大小为42 kd、重组蛋白pPICZαA-NA4-IL-2大小为26 kd,且条带大小符合预期,证明了该重组蛋白在酵母系统中成功表达,诱导时间在48 h时表达量最高。(2)重组蛋白pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2对鸡柔嫩艾美尔球虫保护性试验:将重组蛋白pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-SO7、pPICZαA-NA4-IL-2、pPICZαA-NA4、pPICZαA-IL2分别以重组酵母全菌体破碎蛋白和诱导表达纯化的重组酵母蛋白免疫鸡只,并以1×10 ~4柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫后观察免疫保护效果,按照100μg/羽的免疫剂量进行7日龄首免、21日龄和35日龄各加强一次免疫的免疫程序,用腿部肌肉注射的方法免疫鸡只。结果显示,pPICZαA-SO7-IL2较pPICZαA-SO7、pPICZαA-IL-2免疫组体重增加、盲肠病变减轻、卵囊数量减少。pPICZαA-NA4-IL-2免疫组较pPICZαA-NA4、pPICZαA-IL-2免疫组体重增加、盲肠病变减轻、卵囊数量减少。pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2免疫组ACI最高分别达到175.48和178.69,显示良好的抗球虫效果。发现全菌破碎蛋白对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护效果均优于诱导表达蛋白。利用ELISA法测定免疫后各组鸡只的抗体水平和细胞因子水平,MTT法测定T淋巴细胞增殖。结果表明,在抗体水平上,pPICZαA-SO7-IL2免疫组较对照组与pPICZαA-SO7免疫组较对照组均抗体水平升高极显著(P﹤0.01)。在细胞因子IL-2和INF-γ水平上,pPICZαA-SO7-IL2免疫组较对照组与pPICZαA-NA4-IL-2免疫组与对照组相比均差异极显著(P﹤0.01)。在T淋巴细胞增殖水平上,pPICZαA-SO7-IL2免疫组较对照组与pPICZαA-SO7免疫组较对照组均差异极显著(P﹤0.01)。本试验成功表达了pPICZαA-SO7-IL2、pPICZαA-NA4-IL-2重组酵母蛋白,分别以重组酵母全菌体破碎蛋白和诱导表达纯化的重组酵母蛋白免疫鸡只,并证实了重组酵母蛋白pPICZαA-SO7-IL2与pPICZαA-NA4-IL-2对感染鸡只具有较高的抗球虫效果,为进一步研制具有使用价值的抗球虫疫苗奠定了基础。