【摘 要】
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目的:探索冷冻保存时间对卵母细胞发育能力的影响,以及褪黑素（MT）添加进入冻融液否可以提高卵母细胞中长期冷冻保存效果及其作用机制,旨在建立一种新的人类卵母细胞中长期冻存技术体系。研究对象:使用患者控制性超排卵周期中废弃的未成熟卵母细胞（GV期或MI期）经体外成熟（IVM）技术培养成熟之后作为本研究的成熟卵母细胞（IVM-MII卵母细胞）来源。检测方法及指标:1.将收集的IVM-MII卵母细胞随机分
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目的:探索冷冻保存时间对卵母细胞发育能力的影响,以及褪黑素（MT）添加进入冻融液否可以提高卵母细胞中长期冷冻保存效果及其作用机制,旨在建立一种新的人类卵母细胞中长期冻存技术体系。研究对象:使用患者控制性超排卵周期中废弃的未成熟卵母细胞（GV期或MI期）经体外成熟（IVM）技术培养成熟之后作为本研究的成熟卵母细胞（IVM-MII卵母细胞）来源。检测方法及指标:1.将收集的IVM-MII卵母细胞随机分为五组:新鲜组（F组,作为对照）;非MT处理冻存0个月组（n MC-0组）;非MT处理冻存6个月组（n MC-6组）;10-9M MT处理冻存0个月组（MC-0组）和10-9M MT处理冻存6个月组（MC-6组）;2.复苏后卵母细胞置于400×倒置显微镜下观察形态;3.对F组及冷冻复苏后存活卵母细胞行单精子胞浆注射技术（ICSI）授精,ICSI后行胚胎体外培养,记录并比较早期胚胎发育情况;4.微量蛋白质组学技术检测卵细胞内蛋白表达水平;5.荧光染色法检测并比较五组卵母细内线粒体功能及氧化应激指标,包括ATP、ROS、GSH和ROS/GSH水平。结果:1.冷冻复苏后的各组卵母细胞形态学观察显示:冷冻会造成卵母细胞的结构损伤,10-9M MT的添加可以维持与新鲜组卵母细胞相似的形态;2.卵母细胞后续发育结果:冷冻保存显著降低了卵母细胞的发育能力,并且随着冻存时间的延长,发育能力下降加重;10-9M MT的添加有效保护了卵母细胞的发育能力;3.微量蛋白质组学检测结果:除MC-6组外,F组与其他各组相比,线粒体相关的差异表达蛋白均下调;MT处理组与无MT处理组相比,线粒体相关差异蛋白大部分上调;随着冻存时间的延长,n MC-6组与n MC-0组相比,线粒体相关差异蛋白上下调情况无差异,MC-6组与MC-0组相比,线粒体相关差异蛋白均上调。4.荧光染色检测结果:n MC-0组和n MC-6组卵母细胞内的ATP、ROS和GSH水平与F组相比均存在显著差异;n MC-0组的ATP、ROS和GSH水平与MC-0组相比均存在显著差异,n MC-6组的ATP、ROS和GSH水平与MC-6组相比均存在显著差异;n MC-0组的ATP和ROS水平与n MC-6组相比也存在显著差异;5.ROS/GSH比值结果:无MT处理组的卵母细胞中ROS/GSH的比值显著高于F组及10-9M MT处理组,随着冻存时间的延长,n MC-0组的ROS/GSH的比值显著低于n MC-6组,但MC-0组与MC-6组的ROS/GSH比值无显著性差异,且均与F组相当;6.形成了一套初步的人卵母细胞冻融液产品,并建立了一种有效的用于人类卵母细胞中长期冻存的技术体系。结论:1.低温保存时间的延长将加重人类卵母细胞发育能力的损伤;2.低温保存液中添加10-9M MT可能有效保护线粒体相关蛋白的表达,维护了线粒体功能,如合成ATP,抑制氧化损伤等,从而实现对冷冻卵母细胞发育能力的保护;3.基于褪黑素的应用可以建立一种有效应用于人类卵母细胞中长期冻存的技术体系。
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