论文部分内容阅读
Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,P13K)的功能在低等真核生物、植物和动物中非常保守,能特异磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,Ptdlns)产生磷脂酰肌醇.3.磷酸(PtdIns3P),并在细胞内信号转导和物质运输等过程中发挥着重要作用。植物中的P13K属于Ⅲ型P13K,参与生长发育、气孔运动、根响应盐胁迫和根毛顶端生长等多种生理过程。酵母Vps15及其动物中的同源蛋白是Ⅲ型P13K的调节蛋白,在植物中同样也存在着酵母Vps15的同源蛋白,然而关于它们的功能却知之甚少。本文运用遗传学、细胞生物学及生物信息学的方法对酵母Vps15同源蛋白(AtVPS15)在拟南芥雄配子体中的功能进行了研究。
本文通过对拟南芥AtVPS15蛋白结构分析显示,它与酵母Vps15有着非常相似的结构域构成和豆蔻酰化修饰位点。系统进化分析表明AtVPS15与Vps15物种间亲缘关系相近。在本研究中,我们使用了三个拟南芥T-DNA插入突变体株系,然而在atvps15杂合体自交产生的后代中不能鉴定出纯合体植株。基于PCR的基因型检测和卡那霉素抗性分析发现,atvps15杂合体自交产生的后代表现出非正常的分离比,杂合体与野生型比为1:1。同时atvps15杂合体植株的形态及其生长发育正常,在成熟的角果内未发现败育或者缺失的种子,并且种子能够正常萌发。上述结果表明otvps15杂合突变体不能产生纯合体与胚胎致死无关。通过atvps15杂合体与野生型拟南芥进行正反交实验,分析雌雄配子体遗传转移率发现,雌配子体的遗传转移率正常,而atvps15突变等位基因不能通过雄配子体传递给后代,由此表明AtVPS15突变特异影响花粉功能。通过提取野生型拟南芥不同组织中的RNA,并使用半定量RT-PCR分析AtVPS15的表达模式,结果发现,AtVPS15在所有组织中均能检测到,其在花粉中的转录水平最高。为了研究AtVPS15具体的组织特异性表达,我们将AtVPS15启动子区与GUS报告基因融合并转化野生型拟南芥。转基因植株组织化学染色显示,在花药和成熟花粉粒中有很强的GUS活性,而在营养器官中几乎检测不到。上述表达模式进一步表明AtVPS15在花粉中具有重要作用。将+/atvps15—2植株与qrt1/qrt1突变体进行杂交,获得了基因型~J+/atvps15-2；qrt1/qrt1的植株并用于四分体分析(tetrad analysis)。通过扫描电子显微镜观察、FDA和DAPI染色发现,atvps15-2突变花粉具有活性并含有三个细胞核,其大小、形状以及外壁结构均正常。这些结果表明AtVPS15突变不影响花粉的成熟。对野生型和atvps15杂合体的花粉进行了体外萌发检测发现,在相同条件下,atvps15杂合体花粉萌发率仅为野生型的一半。为了进一步明确这种现象,我们还检测了qrt1/qrt1突变体和+/atvps15-2；qrt1/qrt1植株的四分花粉在体外萌发情况,其结果为qrt1/qrt1突变体的四分花粉能萌发出一到四个花粉管’而+/atvps15-2；art1/qrt1植株的四分花粉只能长出一到两个花粉管。由此表明atvps15突变花粉萌发有缺陷。将全长AtVPS15基因组DNA片段转入atvps15-2杂合体,在T2代中可鉴定出以atvps15-2纯合体为背景的转基因植株。通过对花粉来源于atvps15-2和转基因均为纯合的植株进行体外培养,结果萌发率显著提高。以上结果说明,表达全长AtVPS15基因组DNA可以功能互补雄配子体的缺陷,同时证实了突变体的表型是由于失去AtVPS15功能所导致的。综上所述,由于T-DNA插入破坏AtVPS15导致花粉萌发缺陷,进而影响到纯合受精卵的形成。我们的研究结果说明,酵母Vps15同源蛋白在植物有性生殖过程中发挥着重要作用。