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第一部分:解放军总医院近10年角膜移植适应证和术式变化目的:探讨2004年至2015年本院角膜移植手术适应证和术式的变化趋势。方法:对2004年1月至2015年12月本院施行角膜移植手术的病例进行回顾性调查,分析患者的人口学资料、角膜移植手术适应证和术式的变化趋势。结果:2004年至2015年共有患者631例,角膜移植手术721台。其中男性430例(68.15%)489眼,女性201例(31.85%)232眼。前四位角膜移植手术适应证依次为角膜白斑135例(18.72%),再次手术(已实施1次及以上角膜移植手术患者因角膜原发病复发、植片排斥、植片溶解、人工角膜溶解等需再次手术)122例(16.92%),化脓性角膜炎90例(12.48%),圆锥角膜89例(12.34%)。化脓性角膜炎、再次手术和圆锥角膜逐年增多,2004年化脓性角膜炎、再次手术和圆锥角膜各3、9、3例,2015年分别为16、15、20例。在所有角膜移植手术中,穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty,KP)414 例(57.42%),深板层角膜移植(deep lamellar keratoplasty,DLKP)161例(22.33%),板层角膜移植(lamellarkeratoplasty,LKP)134例(18.59%),角膜内皮移植(endothelia keratoplasty,EKP)12 例(1.66%)。DLKP 和 LKP 近 5 年明显增多,2010 年 DLKP6 例,LKP8 例,2015 年 DLKP20 例,LKP18 例。而 PKP自2012年后有着减少趋势。2012年PKP60例,2015年仅34例。结论:角膜白斑、再次手术、化脓性角膜炎、圆锥角膜是本院角膜移植手术适应证前四位。穿透性角膜移植术式逐渐减少,而深板层角膜移值术式增加。角膜内皮移植术开始逐渐应用到临床。第二部分:结膜下注射骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)应用于角膜碱烧伤修复的初步研究目的:间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)可作为种子细胞应用于组织损伤修复、实体器官移植、治疗自身免疫性疾病以及代谢性疾病。本研究旨在探索结膜下注射骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对角膜碱烧伤急性期的修复作用,为MSCs未来应用于治疗角膜缘干细胞缺乏性疾病提供理论基础。方法:采用1mmol/LNAOH建立兔角膜碱烧伤模型。对实验动物进行随机分组。第一组给予BMSCs(2×106/0.1mlHBSS)结膜下注射,第二组给予0.1ml HBSS结膜下注射,第三组不进行任何治疗。随即应用荧光素钠染色、组织学和分子生物学手段评价实验动物眼表炎症程度及MSCs疗效。结果:BMSCs治疗组的炎症浸润和水肿较轻,且骨髓间充质干细胞可以通过上调TSG-6以及下调TNF-α,IL-1β,MMP-2,MMP-9,VEGF的表达水平来促进兔角膜修复。结论:结膜下注射BMSCs可以减轻兔角膜碱烧伤模型的炎症反应,并通过上调抗炎因子和下调炎症炎子的表达水平加速角膜愈合第三部分:骨髓间充质干细胞来源外泌体的分离及鉴定目的:MSC-based疗法广泛应用于临床试验中。MSC-based疗法的机制主要归因于旁分泌体系中的外泌体。本研究旨在分离提取骨髓间充质干细胞外泌体并进行鉴定,从而为后期外泌体应用于活体动物治疗实验提供方法学基础。方法:外泌体从骨髓间充质干细胞培养上清液(Bone mesenchymal stem cell conditioned medium,BMSC-CM)中提取。先通过差速离心去除死细胞和细胞碎片,然后经超速离心法去除蛋白质,从而得到外泌体。结果:在透射电镜下,外泌体直径约30-150nm,蛋白印迹法(Westernblot)显示外泌体表达CD9和CD81。结论:借助超速离心法可从BMSC-CM中提取外泌体。