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小鼠出生时睑裂是闭合的,这为其相对幼稚的视网膜出生后的继续发育成熟提供了生理性的黑暗环境。我们通过人工开启单侧眼睑的方法,利用C57BL/6J(黑色近交系)小鼠成功建立了过早接受形觉刺激的动物模型,为研究过早光照对视网膜发育的影响提供了较理想的动物模型。前期工作表明,过早光刺激可引发小鼠可逆性的非轴性近视,并伴随视网膜组织中Lumican基因转录活性的显著性激活。本研究在CD1(白色远交系)小鼠中重建并优化了这一模型,详细量化过早光照引发的视网膜结构的发育异常,描述了Lumican异位表达的时间空间分布情况以及相应区域细胞生长与EMT状态的变化。实验从细胞与分子水平为探讨提前光照影响视网膜发育的病理机制、解析过早光刺激与MOP发生的关联提供了佐证。课题主要的研究方法和内容如下:(1)优化过早光刺激小鼠模型,选择CD1新生小鼠替代原有的C57BL/6J作为实验动物,一方面提高了新生小鼠出身率与健康存活比率,更为重要的是,为基于CD1遗传背景的Lumican基因敲除小鼠的引进和深入的机理研究提供可能,实验要求严格杜绝对照眼球的意外感光。我们选择P4作为开睑时间,钝性开启右侧眼睑(记为实验眼,R),以左侧眼球为自身对照(L)。采集P6、P9、P12时间点的眼球制作冰冻切片或于对应时间点抽提视网膜组织总蛋白、总RNA,观察、量化不同时间点新生小鼠视网膜各个核层的细胞增殖与凋亡水平,分析提前光照对视网膜发育影响的时间空间特性。(2)观察上述三个时间点视网膜中Lumican在mRNA与蛋白水平上的异位表达和分布情况;比较在该糖蛋白异常积蓄的时期,相关视网膜细胞增殖、凋亡和EMT的变化,为全面而深入分析该基因的蛋白产物影响神经发育的潜在机制提供第一手实验数据。主要结果与结论如下:(1)过早光刺激对视网膜细胞生长状态的影响H-E染色显示,光刺激对内、外网层及视杆视锥的发育进程并不产生显著性影响,却能明显的改变视网膜细胞的数量:P6-P9H寸期可促进内、外核层与节细胞数量的维持,P10-P12则转而加剧细胞数量的减少。据此,我们将光刺激影响视网膜发育的时相分作早期的生长促进期(P6-P9)与晚期的生长抑制期(P10-P12)。(2)过早光刺激对视网膜细胞增殖水平的抑制以PCNA为细胞增殖指标,量化视网膜细胞的增殖状态。感光细胞增殖活力受过早光刺激的抑制最为敏感,在P9时,ONL中零散分布于边缘区域的PCNA核内荧光信号完全消失,但该异常刺激却并不能改变生长促进期(P6-P9)视网膜细胞的总体增殖状态。进入生长抑制期(P10-P12)之后,光刺激对细胞增殖水平的抑制效应进一步扩展到INL中间神经元,节细胞在P12时生理性的PCNA再度上扬现象在实验眼视网膜中被彻底抑制,视网膜细胞总体增殖水平呈显著性的低下,仅极少数细胞核内呈现出微弱的PCNA阳性信号。(3)过早光刺激对视网膜细胞凋亡水平的影响TUNEL染色分析视网膜细胞的凋亡状态。生理状态下,内外核层细胞凋亡峰值形成时间不同:ONL细胞凋亡高峰出现在P12(自然睁眼前),而INL则发生在P6前后。光照可全程抑制感光细胞的凋亡;对视网膜INL细胞凋亡的影响相对复杂:于生长促进期(P6-P9)抑制中间神经元凋亡,于生长抑制期(P10-P12)则明显延滞INL细胞凋亡水平的迅速下滑。综上所述,光刺激在生长促进期(P6-P9),主要通过抑制神经视网膜(INL+ONL)细胞早期(P6时)凋亡峰的形成、导致大量的细胞存活,从而引起这一时期细胞数量的增多。P12时,尽管光照对感光细胞与中间神经元的凋亡施加了截然相反的影响,但在此时刻,实验眼INL细胞的增殖活力却极度减弱,加之节细胞的PCNA峰未能出现,故生长抑制期(P10-P12)期间,光刺激主要通过对细胞增殖的全面抑制效应来实现细胞数量的回落。(4)过早光刺激诱导视网膜中Lumiean的表达Lumican主要由间充质来源的细胞(如成纤维细胞、角膜细胞)合成,在视网膜、脑等外胚层起源的神经器官组织中表达低下。光照引发视网膜中Lumican转录水平的激活始发自P9,于P12达高峰,睁眼后迅速回落,至P21重新恢复沉寂。P9时,极其微量的Lumican蛋白产物可在视网膜组织总蛋白提取液中检出,以后其含量急剧增多,P12时可见65kDa的宽幅蛋白条带——视网膜中表达的Lumican是糖蛋白而非KSPG。P12时,Lumican糖蛋白主要分布在外网层以内的神经组织中,这包括:内外网层、INL与GCL,主要影响中间神经元与节细胞的生长、转化行为。(5) Lumican异位表达与相关细胞增殖水平的抑制以PCNA为细胞增殖指标,对P9和P12时的INL与GCL的细胞增殖状态进行了进一步的量化。随着Lumican在神经视网膜INL与GCL中的蓄积,相应区域新生细胞数量锐减明显,这一方面体现在P12时(Lumican异常蓄积高峰时刻)INL细胞PCNA核内信号显著性减少,一方面表现为GCL中PCNA上扬现象的完全消失。(6) Lumican异位表达与相关细胞凋亡水平的维持为了准确评价视网膜INL与GCL细胞的凋亡状态,我们选择了Caspase-939kDa活性肽段——p39作为细胞凋亡量化指标。免疫荧光检测证实,Caspase-9标记的细胞分布在视网膜(INL+GCL)核层中,而ONL中未见荧光信号;Western-blot确证该分子在这两个核层中的存在形式主要是p39活性肽段,未见全长(49kDa)条带出现,说明此抗体可以特异性标记INL与GCL中的凋亡细胞。随着Lumican在视网膜中的聚集,P12时相对于对照组细胞凋亡水平的进行性锐减,实验眼视网膜Caspase-9 p39依旧维持在相对较高的水平,说明光刺激可于生长抑制期(P10-P12)引发这两个核层细胞较为明显的凋亡。综合上述结果我们发现,随着Lumican糖蛋白在神经视网膜内侧区域的积蓄,相应分布区域的视网膜细胞表现出增殖活性的锐减与凋亡水平的相对维持,其综合效应将导致(INL+GCL)细胞生长活性的减低、细胞数量的减少。这一发现揭示了,Lumican可能参与了光刺激对生长抑制期间(P10-P12)相关核层细胞生长的调节。参考Lumican对间充质来源细胞(如角膜细胞)具有抑增殖促凋亡的调控作用,我们据此推测,该分子对来源于神经上皮的视网膜细胞也有相似的作用。正是由于光刺激引发Lumican转录水平的激活以及其糖蛋白产物在P9-P12的迅速蓄积,导致相同的刺激对不同时期的视网膜(尤其是INL与GCL)发育产生截然相反的影响——由前期的促进生长转入后期持续的抑制。(7) Lumican异位表达与EMT值得我们注意的是,光照并非立即诱发Lumican在视网膜中的异常表达。而上皮细胞尽管在特殊应激诱发(如损伤)下,可以重新开启Lumican的合成潜力,但通常需经历EMT,且Lumican异位表达后还可以进一步维持这种异常转化状态。以α-SMA作为EMT量化指标、分析P6、P9、P12时间点视网膜EMT状态,发现光刺激可引发P6时α-SMA在视网膜中的广泛提升以及P9时(INL+GCL)中α-SMA的富集效应,提示Lumican的表达继发于光刺激诱发的P6-P9时期EMT的上扬。P12时,视网膜EMT还出现了一次较高水平的维持,这一反弹现象伴随着Lumican表达高峰的出现,提示二者之间潜在的关联性。