研究背景糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见而严重的微血管并发症之一,临床表现为视力下降、视网膜微血管瘤、眼底出血、渗出、水肿,出现新生血管,最终因新生血管膜破裂导致玻璃体出血、机化、牵拉视网膜引起视网膜脱离而失眠。DR是糖尿病患者致盲的重要原因。在诊断糖尿病10-15年后,几乎所有的1型糖尿病(Typel Diabetes mellitus, T1DM)患者以及60%以上的2型糖尿病(Type2 Diabetes mellitus, T2DM)患者都会并发DR。DR严重影响患者生存质量,并带来高昂的医疗开支,加重社会负担。目前对DR的预防和治疗还没有理想的措施。临床上,大量的DR患者早期并不出现明显的症状,因此,探索DR的发病机制、发现早期诊断DR的蛋白分子标记物对改善DR预后具有重要意义。DR的发病机理十分复杂,多年来国内外学者进行了大量动物实验和临床研究,并取得一定的进展,主要认为DR的发生和发展与山梨醇或醛糖还原酶通路、非酶糖基化产物、视网膜生长因子、视网膜毛细血管血流改变和毛细血管通透性增加等诸多致病因素有关,但这些研究结果缺乏对其复杂的生化和分子机制的全面了解。众多研究表明,DR形成是多因素多步骤的复杂生物学过程,单一的分子研究并不能解释其机制。近年来,迅速发展的蛋白质组学技术为高通量的分子标记研究提供了可靠的技术平台,使我们从多因素水平探明DR发病机制、寻找DR早期诊断的特异分子标记物等方面的研究得以实现。蛋白质组学作为一门新兴的学科,着重于从整体水平上研究生物体的功能。应用蛋白质组学的研究方法能够全面揭示组织或细胞内蛋白质的表达状况。目前,许多研究者已利用蛋白质组学技术成功地建立了疾病的蛋白质图谱,并发现了疾病的相关分子标志物。不断完善的蛋白质研究技术以及随基因组计划发展起来的生物信息学数据库和分析软件,为大规模研究蛋白质组提供了可行性的技术支持。对于DR而言,通过比较正常和疾病状态下表达蛋白的差异,可揭示参与DR病理过程的多种因子和调控网络,发现新的与DR病理过程相关的蛋白。该技术对深入、系统地研究DR发生发展的病理机制,确定有效预防和治疗药靶方面具有独特的优势。目前有关DR的蛋白质组学研究多以患者的玻璃体液或动物模型眼组织取材进行分析,但二者均有一定的缺陷：玻璃体液通常取材不方便,且DR患者存在血-眼屏障的破坏对研究结果有影响；而动物模型眼并不能真实地复制人类DR患者的特征。另一方面,随着疾病的血清蛋白质组学技术的深入发展,以血清为标本所开展的蛋白组学研究,能更加清晰、真实地显示蛋白的表达情况。这些与疾病密切相关的、潜在的可作为疾病诊断的血清分子标志物主要是一些低丰度蛋白,其所占比例不足血清总蛋白的1%,它们通常被占血清总蛋白70%以上的白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白掩盖、干扰而无法分离和鉴定。因此,对疾病进行血清蛋白质组学分析时,选择灵敏度高、可信度强的蛋白质组学技术非常关键。蛋白质组学研究的支撑技术主要是双向凝胶电泳技术(two-dimensionalgel electrophoresis,2-DE)和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术以及生物信息技术。2-DE是蛋白质组学研究中最常见的蛋白质分离技术。目前又已涌现出许多更为新颖的蛋白质组分析方法,其中荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis,DIGE)技术由于继承了2-DE的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,使得DIGE日益受到关注,成为最受欢迎的定量蛋白质组学研究手段之一。DIGE是一种在2-DE之前进行荧光染料标记蛋白样品的方法,通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记,在同一块双向凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品,并且每块胶上又引用了内标,内标的利用进一步增加可信度,确保结果能反映出真实的生物学差异,避免了系统误差实验结果的影响,从而能够对样品间蛋白质丰度差异进行精确分析。怎样使DR患者能得到及时有效的预防和治疗?在临床上如何确立哪些DR患者属于需要及早干预的目标人群?应用蛋白质组学研究筛选不同时期DR患者血清差异蛋白方法是否可行?从蛋白质组学整体分子研究的水平出发,到底有哪些重要蛋白与DR的发生、发展过程有关?正是带着这样的实际问题我们选择了此项课题。本研究选择血清为标本,采用荧光差异双向凝胶电泳(Two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)分离技术联合激光解吸电离/飞行时间-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight tandem mass spectrometry, MALDI-TOF-TOF MS)技术,筛选2型糖尿病DR患者血清特异分子标记物,国内外文献鲜有类似报道。研究目的1.探讨2D-DIGE联合MALDI-TOF-TOF MS技术对不同时期DR患者血清进行差异蛋白质组学研究的可行性。2.通过对不同时期DR患者和健康对照者的血清进行差异蛋白质组学分析,筛选DR患者血清中的差异表达蛋白和特异分子标志物,为从蛋白质组学这一多分子研究水平出发探讨DR的发生、发展过程提供实验依据。3.对不同时期DR患者血清中筛选的差异蛋白进行临床验证,阐明血清特异分子标志物的临床意义和应用价值。为寻找DR血清候选标志物以及可能与DR的发生发展机制相关的蛋白质提供新的线索。方法1.研究对象：收集符合本实验纳入、排除标准的T2DM患者24例,根据DR病变严重程度,将其分为3组：无明显视网膜病变(No-DR, NDR)组8例；非增殖性糖尿病视网膜病变(non-Proliferative Diabetie Retinopathy, NPDR)组8例；增殖性糖尿病视网膜病变(Proliferative Diabetie Retinopathy, PDR)组8例；以及年龄、性别相匹配的健康志愿者8例作为正常对照(normal control, NC)组。2.血清样本收集 空腹收集入选者肘静脉血标本,离心后吸取上层血清,分装,-80℃保存备用。3.血清高丰度蛋白去除结合缓冲液稀释血清去除高丰度蛋白。离心收集已去除白蛋白及IgG的滤过液。用洗脱结合白蛋白和IgG的结合柱,离心收集洗脱液,分装-80℃冻存。4.蛋白样品纯化用2-D Clean-up Kit进行蛋白纯化。5.蛋白浓度测定使用EttanTM 2-D Quant Kit测定蛋白浓度。根据标准曲线和蛋白样品的吸光度值计算样品蛋白含量。6.2D-DIGE蛋白质分离建立两块DIGE胶,分别为胶A和胶B。将实验各组8份经上述处理过的血清等量混合成4份样本,再将4份样本等量混合组成内标。使用三种特殊的荧光染料Cy2、Cy3、 Cy5,对各组进行标记反应。标记好的样品蛋白上样到非线性固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)胶条,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Surfate-pplyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)胶浓度12.5%。Typhoon 9400 scanner成像仪对电泳后的胶板图像扫描,Cy2、Cy3以及Cy5分别进行488/520nm、532/580nm、633/670nm波长激光扫描,蛋白质点数最多的胶设为参考胶,其余的胶与之相匹配,匹配的点进入下一步分析。用DeCyder 2D 7.0分析软件行胶内差异分析(Differential In-gel Analysis, DIA),以蛋白质点平均体积差异大于1.5倍(表达差异上调1.5倍或下调1.5倍)寻找差异表达的蛋白质点。对样品加大上样量后重新进行普通双向凝胶电泳建立制备胶。第二向凝胶电泳结束后行考马斯亮蓝G-250胶内染色。将分析胶和制备胶进行匹配,寻找相匹配的差异蛋白点。利用EttanTM Spot picker自动工作站进行挖胶,挖到的胶粒取出置EP管中-20℃冻存,进行下一步质谱鉴定。7.应用MALDI-TOF-TOF MS技术对差异蛋白进行质谱鉴定及数据库搜索。对差异蛋白点进行胰蛋白酶(Promega)胶内酶解。将制备好的样品使用MALDI-TOF-TOF MS质谱仪进行肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprinting,PMF)分析。选择最强的10个峰获取串联质谱(tandem mass spectrometry,MS/MS)数据。将MS和MS/MS获得的蛋白质肽质量指纹数据通过Mascot搜索引擎在Swiss-Prot数据库中进行检索,获得相关蛋白的生物信息学数据。8.应用Western blot方法对筛选的血清差异蛋白——β2-糖蛋白I (beta 2-glycoprotein I, β2GPI)进行临床验证。在收集80例入选者血清标本中,实验各组随机抽取4份血清样本,应用Western blot方法对样本中β2-GPI水平进行分析。采用Quantity one专业分析软件测定各条带的面积平均光密度值。9.统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验中计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数比较进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐性时组间多重比较采用LSD法,方差不齐时则采用Welch法进行组间均数比较,P<0.05为差异有统计学意义。胶内差异分析由DeCyder v.7.0软件自动完成。结果1.各组平均蛋白质浓度NC组：5.6mg/ml, NDR组：6.1mg/ml, NPDR组：5.8mg/ml, PDR组：5.5mg/ml。2.成功获得不同时期DR患者血清2D-DIGE图谱。经DeCyder 2D 7.0分析软件对图像进行配比分析,胶A蛋白质点为1854个,胶B蛋白质点为1613个,以标准的rati。1.5寻找差异表达显著的蛋白质点,共检测到26个差异表达蛋白点。与NC组相比较,NDR组有7个差异蛋白点上调,6个差异蛋白点下调；NPD R组有11个差异蛋白点上调,4个差异蛋白点下调、PDR组有9个差异蛋白点上调,4个差异蛋白点下调。3.筛选的26个差异蛋白点中有24个差异蛋白点得到鉴定。2个差异蛋白点未能鉴定。共鉴定出15种蛋白。大部分为血清高丰度蛋白,分别是血清白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、触珠蛋白、丛生蛋白和铜蓝蛋白。10kDa以下的低分子量蛋白质未能分离出来。对探讨发病机制和诊断疾病有意义的相对低丰度、低分子量蛋白有4个,分别是β2-GPI、α2-HS型糖蛋白(alpha2-HS-glycoprotein, AHSG)、α1-酸性糖蛋白(alphal-acid glycoprotein, α1-AGP)和载脂蛋白A-1 (apolipoprotein A-1, apo A-1) 。但4个蛋白点中,只有β2-GPI的表达水平呈有规律的变化,表现为随着DR的病情进展,其表达水平在不同分期中逐渐上调。以标准的蛋白质点体积比ratio>1.5计算蛋白质点差异表达量(DeCyder 2D 7.0软件自动分析)：与NC组比较,β 2-GPI水平在NDR组上调1.54倍、NPDR组上调2.43倍、PDR组上调2.84倍；与NDR组比较,β2-GPI水平在NPDR组上调1.58、PDR组上调1.84；但与NPDR组比较,β2-GPI水平在PDR组仅上调1.17倍。由此推测β2-GPI可能与DR的发生发展过程有关,作为DR早期诊断的分子标志物的可能性最大,并确定P2-GPI作为后续实验中的研究目标。4.Western blot分析结果：各组血清中均检测到50 kDa片段的β2-GPI的表达。肉眼观察p2-GPI水平在NPDR组、PDR组大量表达；在NDR组中量表达；在NC组少量表达。计算NC组、NDR组、NPDR组和PDR组各条带面积平均光密度值,分别为440564.9±66597.4、655561.6±85640.8、859969.7±85461.0、954887.4±125764.4。与NC组比较,P2-GPI水平在NDR组、NPDR组、PDR组显著升高,差异有统计学意义(p<0.01)；与NDR组比较, β2-GPI水平在NPDR组、PDR组显著升高,差异有统计学意义(p<0.01)；与NPDR组比较,PDR组无明显升高,差异无统计学意义(p>0.05)。说明血清中β2-GPI水平在DR患者早期阶段即开始升高,出现明显DR改变后进一步升高,但其后无明显变化,亦即与DR严重程度无关。其变化趋势和蛋白组学实验结果相一致。结论1.应用2D-DIGE联合MALDI-TOF-TOF MS技术对不同时期DR患者血清进行差异蛋白组学分析方法可行。2.2D-DIGE技术仍然不能突破其基于2-DE的内在局限性,即无法识别相对分子量较小(10kDa以下)的蛋白和低丰度蛋白。3. β2-GPI可能与DR的发生发展过程有关,是早期诊断DR的可能的血清潜在分子标志物。创新1.应用2D-DI（ GE联合MALDI-TOF-TOF MS技术成功建立不同时期DR患者和健康对照者血清差异蛋白质组学图谱。2.提出血清β2-GPI可能参与了DR的发生发展过程的观点,为探讨β2-GPI作为早期诊断DR的血清分子标记物的可能性提供了实验依据。