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研究目的:乳腺癌组织内的微环境是肿瘤细胞产生、增殖、侵袭和转移的必要物质基础。血管内皮生长因子C(VEGF-C)能够在肿瘤微环境中引起微淋巴管的生成,参与肿瘤细胞的转移以及诱导免疫耐受,然而VEGF-C对乳腺癌肿瘤微环境的作用机制尚未完全明确。本研究以小鼠乳腺癌4T1细胞和树突细胞为切入点,采用RNAi方法干扰VEGF-C表达,通过体外和体内试验,从分子、细胞及动物整体水平探讨VEGF-C与肿瘤微环境之间的关系及其作用机制。研究方法:1.体外实验:设计、化学合成三对靶向小鼠VEGF-C的siRNA,在细胞水平应用转染试剂将三对siRNA分别转染到4T1细胞内,继续培养48小时后,提取出细胞内的m RNA与蛋白,使用RT-PCR与Western blot方法检测VEGF-C的表达水平,筛选出沉默效率最高的一对siRNA;随后在体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞,采用MTT比色法、Hochest33258荧光染色、流式细胞术及划痕实验检测靶向干扰VEGF-C对4T1小鼠乳腺癌细胞的增殖、迁徙和凋亡的影响;应用RT-PCR、ELISA与Western blotting方法检测靶向干扰VEGF-C对于4T1细胞CCR7、CCL21、VEGFR-3、KLF-2与survivin的表达水平、AKT蛋白的磷酸化水平以及Caspase-3的活化水平的影响;体外培养从小鼠股骨中分离培养的树突状细胞,通过脂质体转染siRNA靶向干扰小鼠树突状细胞的VEGF-C表达,应用ELISA、RT-PCR、Western blotting方法检测鼠DC细胞VEGF-C、VEGFR-3、KLF-2与survivin的表达水平、AKT蛋白的磷酸化水平以及Caspase-3的活化水平;应用流式细胞术与MLR技术检测小鼠树突状细胞表型、凋亡与刺激同种异型淋巴细胞的能力变化。2.体内实验:用4T1细胞接种于Balb/c小鼠的皮下,建立荷瘤动物模型,进行瘤内药物注射,观察靶向干扰VEGF-C对肿瘤生长和转移的影响。瘤内注射结束后,处死小鼠,TUNEL染色检测肿瘤内细胞凋亡状况;ELISA法检测肿瘤组织中VEGF-C与CCL21蛋白的表达;流式细胞术检测瘤内侵润DC与Treg细胞的分布状况;应用免疫组化法与ELISA方法检测瘤组织内VEGF-C、p AKT、KLF-2、Survivin和VEGFR-3蛋白的表达以及微淋巴管密度,探讨靶向干扰VEGF-C的体内抗肿瘤作用及其对肿瘤微环境的影响机制。结果:1.体外实验:RT-PCR与Western blot方法检测结果显示设计合成的三对siRNA中,si V2转染对4T1细胞的VEGF-C沉默效率最高;100n M浓度的si V2转染4T1细胞48小时后,RT-PCR及Western blot结果显示4T1细胞中的VEGF-C、VEGFR-3、p AKT、KLF-2及Survivin的m RNA与蛋白表达均显著下降而活化Caspase-3蛋白表达显著增加;ELISA结果显示4T1细胞上清中VEGF-C与CCL21浓度明显降低;MTT结果显示4T1细胞增殖显著降低;Hochest33258染色结果显示4T1细胞出现典型的凋亡形态学改变;流式细胞术结果显示4T1细胞的凋亡率显著增加而CCR7表达显著下调;细胞迁徙实验显示4T1细胞的迁移能力显著降低。si V2转染小鼠树突状细胞48小时后,ELISA结果显示小鼠DC培养上清中VEGF-C浓度明显降低;流式细胞术结果显示小鼠DC的凋亡率明显增加;RT-PCR及Western blot结果显示小鼠DC的VEGF-C、VEGFR-3、p AKT、KLF-2及Survivin表达均显著降低而活化Caspase-3蛋白表达明显增加。LPS刺激24小时后,经流式细胞术检测,结果显示si V2转染小鼠DC的CD86、I-Ad与CCR7表达明显低于对照组,而CD80表达却无明显差异;MLR结果显示si V2转染小鼠DC的刺激同种异型淋巴细胞的能力显著降低。2.体内实验:动物实验结果显示与空白组及平行对照组相比较:si V2瘤内注射能够明显抑制移植瘤的增长和肺转移;TUNEL染色结果显示肿瘤组织中凋亡细胞明显增多;免疫组化结果显示肿瘤组织内VEGF-C、p AKT、KLF-2、Survivin及VEGFR3蛋白表达与微淋巴管密度明显降低;ELISA结果显示肿瘤组织中VEGF-C与CCL21表达明显降低;流式细胞术结果显示肿瘤内浸润的树突状细胞及Treg细胞数目明显减少,肿瘤细胞与浸润树突细胞的CCR7表达均明显降低,浸润树突细胞的CD80、CD86、I-Ad表达组间无明显差异,但表达率均低于成熟DC。结论:VEGF-C干扰可以在体内外下调4T1细胞的CCR7与CCL21表达、抑制4T1细胞的增殖、促进4T1细胞的凋亡;VEGF-C干扰可以在体外抑制小鼠树突状细胞的成熟、促进小鼠树突状细胞的凋亡、在体内外水平降低小鼠树突状细胞CCR7的表达;VEGF-C干扰能够在体内水平抑制小鼠乳腺癌肿瘤的增长和肺转移,并能够降低肿瘤微环境中Treg与幼稚DC的数目及微淋巴管密度。该作用机制可能与VEGF-C表达沉默后,VEGFR-3表达降低,胞内PI3K/AKT信号通路中的AKT磷酸化水平降低,以及凋亡抑制蛋白survivin和转录因子KLF-2表达下调有关。意义:本课题设计并筛选出高效的针对小鼠VEGF-C的siRNA,以4T1细胞及小鼠DC细胞为切入点,从分子水平、细胞水平及动物整体水平探讨VEGF-C沉默对小鼠乳腺癌肿瘤细胞的生物学性状以及肿瘤微环境的影响机制。本项研究为乳腺癌基因治疗的临床应用打下了基础。