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CRISPR/Cas9是当前最热门的基因编辑工具,它由sgRNA和Cas9蛋白两个组份构成。通过与其靶基因的碱基互补配对,sgRNA将核酸酶Cas9招募到靶基因上并切割靶基因,从而实现位点特异性基因编辑。经典的真核生物CRISPR/Cas9表达系统是以RNA聚合酶II和III启动子分别转录Cas9蛋白的mRNA和sgRNA。相比于RNA聚合酶III启动子,RNA聚合酶II启动子的转录水平可以被调控并且其能转录更长的RNA。以RNA聚合酶II启动子表达sgRNA,一方面可以更好的实现对sgRNA表达的过程控制,另一方面有望转录出较长的sgRNA多顺反子,以便进行多基因编辑。虽然CMV(一种常用的RNA聚合酶II启动子)与U6启动子(一种常用的RNA聚合酶III启动子)转录TLR1.1 sgRNA的水平基本相当,但是CMV转录的TLR1.1 sgRNA无法实现基因编辑功能,而U6启动子表达的TLR1.1 sgRNA能使90.3%的报告质粒产生移码突变。我们猜测可能是RNA聚合酶II转录产物中的帽子或polyA尾巴等结构导致了sgRNA的失活。为了以RNA聚合酶II表达功能性sgRNA,我们设计了两套新的表达的策略,分别命名为miRNA based sgRNA和RISC based sgRNA。利用细胞内源性的RNaseIII切割RNA聚合酶II转录产物,使之去除帽子、尾巴等特殊结构以保证sgRNA的活性和功能。miRNA based sgRNA表达策略是将sgRNA嵌入miRNA多顺反子之间,利用Drosha和Dicers对miRNA的加工将sgRNA从初级转录本中释放出来。RISC based sgRNA表达策略则是利用RISC复合物(一种RNA指导的RNaseIII)对sgRNA的初级转录本进行加工。两套策略都能使CMV表达的sgRNA具有基因编辑的活性。核酸酶切分析表明,CMV启动子表达的miRNA based sgRNA能使68~72%的报告基因发生移码突变,接近U6表达的sgRNA的编辑效率(87.7%)。本研究还发现,虽然置于miRNA多顺反子中第一个miRNA的上游的sgRNA无法进行基因编辑,但对报告基因的表达仍有轻微的抑制作用,暗示其虽然其不再具有核酸酶活性,但仍能结合靶基因从而干扰靶基因转录。在miRNA多顺反子的其它部位插入sgRNA则能使miRNA和sgRNA正常表达并发挥基因编辑的功能。Northern blot分析表明,含帽子结构的sgRNA分子量较大,可能与帽子结构对sgRNA 5’端冗余序列的保护有关。结合Cas9:sgRNA:DNA复合物的三维结构,本研究进一步提出“剪刀阻遏模型”用以解释含帽子结构的sgRNA能抑制靶基因表达但无法进行基因编辑的现象。利用神经特异性启动子hSynapsin表达sgRNA成功在神经细胞中有效编辑了报告基因,而在肾源性细胞中无法进行基因编辑,表明miRNA based sgRNA可以很好的实现组织特异性基因编辑。利用该策略串联表达多个sgRNA还能在编辑报告基因的同时实现对内源性p53基因的编辑。其对报告载体和内源性p53基因的编辑率分别达到了100%和30.3%,其中对内源性基因的编辑效率也与文献报道中U6启动子转录的sgRNA编辑效率相当,表明miRNA based sgRNA策略可以利用一个启动子一次性实现多个sgRNA表达,便于多基因编辑。最后,本研究还利用miRNA based sgRNA表达技术在表达sgRNA的同时表达了Lig4shRNA。并通过qRT-PCR的实验验证高达80%的内源性Lig4基因表达受到抑制,且同源重组基因修复的概率提高了3倍左右,这为执行更为精确的基因编辑提供了一种可行的策略。总之,本研究成功开发了miRNA和RISC介导的sgRNA表达策略,藉此可以实现利用RNA聚合酶II启动子表达sgRNA进行基因编辑。利用miRNA based sgRNA,实现了组织特异性基因编辑,多基因编辑以及提高同源重组基因编辑效率等多个方面的应用,充分发挥了RNA聚合酶II启动子表达可控且转录本较长的特性。此外,本研究发现凡是含有帽子结构的sgRNA都缺乏核酸酶活性,并且证明了细胞质中加工成熟的sgRNA亦可以与Cas9共转运回细胞核进行基因编辑,从而否定了以往的“亚细胞分布理论”,并进一步提出了帽子结构和冗余序列介导sgRNA核酸酶活性缺失的“剪刀阻遏模型”,为深入理解CRISPR/Cas9系统的工作原理以对其进行进一步的改造奠定了理论基础。