【摘 要】
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[目 的]器官移植后的免疫排斥问题一直是临床上尚未彻底解决的难题。如何诱导移植后的免疫耐受一直是医学界持续关注的焦点。骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells,bMSC）具有干细胞特性及多向分化潜能,转化生长因子β 1（Transforming Growth Factor β 1,TGF-β 1）能刺激未成熟的CD4+T细胞分化,抑制效应T细胞的活化和增
【基金项目】
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国家自然科学基金基金号:81460132；
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[目 的]器官移植后的免疫排斥问题一直是临床上尚未彻底解决的难题。如何诱导移植后的免疫耐受一直是医学界持续关注的焦点。骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells,bMSC）具有干细胞特性及多向分化潜能,转化生长因子β 1（Transforming Growth Factor β 1,TGF-β 1）能刺激未成熟的CD4+T细胞分化,抑制效应T细胞的活化和增殖,上调调节性T细胞（Regulatory cells,Treg）,从而导致了机体的自身免疫耐受。成功构建过表达TGF-β1的 MSC 细胞株 cMSCs-TGF-β1,分别将 cMSCs-TGF-β1、MSC 细胞与与 T淋巴细胞共培养,探讨cMSCs-TGF-β1细胞与Treg细胞在自体免疫耐受中相互作用。[方法]1.采集比格犬外周血,密度梯度离心法收集犬核细胞,进行密度梯度离心处理,使用免疫磁珠法获得比格犬T淋巴细胞并鉴定,冻存。2.血球计数板计数T淋巴细胞,将MSCs和cMSCs-TGF-β1细胞株与T淋巴细胞共培养,流式细胞仪检测CD4+CD8+T细胞和CD4+CD25+T细胞比例。3.实时定量PCR与免疫印迹法检测共培养液中IL17、Foxp3和RORγt的表达量。4.利用双抗夹心法对两组细胞培养液中细胞因子IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21和IL-22定量检测。[结果]比格犬的骨髓间充质干细胞的成脂诱导鉴定,经过染色后在显微镜下可以见到该细胞中的许多脂滴形成被油红0染为红色,流式细胞仪对MSC细胞表面标志物进行鉴定,细胞高表达CD29、CD90、CD44,而低表达CD105、CD34,证明培养细胞为MSC。通过蛋白印迹检测,MSC细胞成功过表达目的基因TGF-β1,获得cMSCs-TGF-β1细胞株。比格犬外周血中提取犬混合淋巴细胞,显微镜观察比格犬T淋巴细胞,可见少量圆形细胞变为不规则细胞,且有不规则的毛刺状态,成功提取T淋巴细胞。将MSCs和cMSCs-TGF-β1细胞株分组与T淋巴细胞共培养,流式细胞仪对混合培养的淋巴细胞的测结果提示:与对照组相比,在MSCs和cMSCs-TGF-β1的分别刺激下,CD4+CD25+T细胞的比例都明显增加,且cMSCs-TGF-β1组的增加幅度远大于MSCs组;CD4+CD8+T细胞的比例都明显下降,且cMSCs-TGF-β1组下降幅度,明显大于MSCs组。实验组中TGF-β1/MSCs中RORγt基因的表达量低于对照组（P<0.01）,Foxp3基因的表达量高于对照组（P<0.01）。免疫印迹法对T细胞中IL17、Foxp3和RORγt的表达检测结果提示实验组TGF-β1-MSCs中IL-17和RORγt的基因表达量明显低于对照组（P<0.01）,Foxp3的基因表达量明显高于对照组（P<0.01）。ELISA检测:实验组TGF-β1-MSCs中IL-10的基因表达量明显高于对照组（P<0.05）,IL-17A、IL-21和IL-22的基因表达量明显低于对照组（P<0.01）。实验组和对照组中IL-4的基因表达量无明显差异（P>0.05）。[结论]在含过表达TGF-β1的cMSCs-TGF-β1细胞株中与比格犬T淋巴细胞共培养,能抑制炎症的发生发展,促进淋巴细胞向调节性T细胞的分化,可能促进免疫耐受的形成。
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