论文部分内容阅读
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),最著名的特点是引起动物呕吐又称为呕吐毒素,是由镰刀菌产生的一种毒素能广泛污染谷物和饲料,对人和动物有着严重的毒性效应。本试验以牛乳腺上皮细胞(MAC-T)作为研究对象,探究DON对MAC-T细胞的体外细胞毒性及其潜在的分子机制。而有效改善MAC-T细胞的DON的中毒效应也具有重要的意义。近年来紫檀芪(Pterostilbene,PTE)这种天然植物性物质由于具有高效抗炎,抗氧化作用和对细胞再生作用,被广泛研究使用。首先使用不同浓度DON(0.1,0.25,0.3,0.5,0.8,1,2μg/mL)处理MAC-T细胞24 h后通过CCK8检测细胞活力筛选出本试验所使用的合适的DON作用浓度。结果显示当使用大于等于0.25μg/mL浓度的DON处理细胞时,DON使细胞活力显著下降。0.25μg/mL浓度的DON处理细胞24 h后细胞内LDH释放,细胞膜完整性遭受破坏。DON引起显著的GSH耗竭,T-SOD降低,脂质过氧化MDA的增多和总抗氧化能力(T-AOC)降低。DON处理细胞不同时间段(9 h,15 h,24 h)后,在荧光倒置显微镜中观察到DON使MAC-T细胞中绿色荧光强度显著增加,ROS含量增加。DON上调基因NF-κB P65、NF-κB P50、COX-2、MyD88、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达。另外,TNF-α,IL-6和IL-8的表达有明显得时间相关性增加;NF-κB P50、COX-2和MyD88的表达有明显得时间相关性减少;NF-κB P65和IL-1β的表达没有明显的时间相关性变化。0.25μg/mL浓度的DON处理细胞24 h后,使用流式细胞术方法检测细胞周期变化,结果显示DON使MAC-T细胞G0/G1期阻滞,S期减少影响细胞周期进程进而阻止细胞的正常增殖。另外,使用Annexin V-FITC测量细胞凋亡率,结果显示MAC-T细胞凋亡率的增加。DON通过增加促凋亡基因Bax的mRNA表达水平,Bcl-2不表达和Bax/Bcl-2表达比率增加诱导MAC-T细胞凋亡。使用试验中细胞活力和荧光定量PCR基因表达结果探究出的DON使用浓度(0.25μg/mL)和作用时间(9 h),首先使用不同浓度的PTE(2,4,8,16μM)处理MAC-T细胞9 h,通过CCK8测定细胞活力分析出此浓度范围的PTE无细胞毒性,之后不同浓度PTE与DON(0.25μg/mL)的不同组合浓度处理MAC-T细胞9 h后,筛选出合适的PTE保护剂量(8μM)。将试验分为四组:对照组(CON),浓度为0.25μg/mL DON处理组(DON),浓度为8μM PTE处理组(PTE),PTE(8μM)和DON(0.25μg/mL)组合处理组(P+D),孵育MAC-T细胞9 h,通过结晶紫法测定细胞增殖,结果表明PTE可有效改善DON对MAC-T细胞增殖的抑制作用。PTE可有效提高MAC-T细胞T-AOC来抵抗DON对细胞氧化损伤的影响,减少了DON对MAC-T细胞中ROS和MDA的产生,改善了DON诱导的GSH耗竭。PTE抑制DON诱导MAC-T细胞中iNOS和NO的产生。PTE可有效调节Nrf2、Keap1、SOD1和SOD2 mRNA的水平来抵御DON对MAC-T细胞的影响。PTE可以明显抑制DON诱导MAC-T细胞激活的关键转录因子NF-κB P65、P50以及下游的炎症介质炎性细胞因子COX-2、IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA的水平。ELISA结果显示,PTE抑制DON诱导细胞产生的TNF-α和IL-6的蛋白表达。总之本研究证明了DON对MAC-T细胞产生的毒性作用,不同程度的损害MAC-T细胞,影响细胞正常功能。PTE缓解DON对MAC-T细胞的中毒效应,改善DON对细胞的氧化损伤和炎症反应,提高抗氧化能力和抗氧化酶水平,降低一氧化氮,活性氧水平和炎性细胞因子表达达到抗氧化和抗炎作用。