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目的:探讨利拉鲁肽或脐带间充质干细胞单用及联用对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病大鼠糖脂代谢、胰岛素抵抗和肝脏损伤的改善作用,并进一步探讨其与TLR4/NF-κB炎症信号通路和氧化应激机制间的关系。方法:1.动物模型建立与实验分组及干预:雄性SD大鼠90只,按照随机数字表法分为正常对照组(NC组,n=10)和T2DM合并NAFLD造模组(n=80)。正常组喂养常规饲料,造模组喂养高糖高脂饲料8周。第8周末分别随机处死2只正常组和5只造模组大鼠,与正常组比较,造模组大鼠空腹血糖、肝功能、血脂谱和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显增高,光镜下可见肝细胞呈中度弥漫性脂肪变性判定为NAFLD模型标准。进一步腹腔注射STZ(30mg/kg),72 h后以连续三天空腹血糖≥11.1mmol/L判定为T2DM合并NAFLD成模,共54只,成模率72%。成模大鼠再次随机选取40只,并分为以下四组进行为期8周的干预治疗:T2DM合并NAFLD模型组(模型对照组,MC组);脐带间充质干细胞治疗组(MC+hUC-MSCs组);利拉鲁肽治疗组(MC+LIRA组);利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞治疗组(MC+LIRA+hUC-MSCs组)。每组鼠数均为10只,分别给予相应的药物干预治疗8周。其中,脐带间充质干细胞干预组(MC+hUC-MSCs组,MC+LIRA+hUC-MSCs组)在干预第1、5周尾静脉注射含脐带间充质干细胞数目为1×106个的培养液100μl;未用脐带间充质干细胞干预组(NC组,MC组,MC+LIRA组)在干预第1、5周尾静脉注射不含脐带间充质干细胞的培养液100μl;利拉鲁肽干预组(MC+LIRA组,MC+LIRA+hUC-MSCs组)皮下注射利拉鲁肽200μg/kg,每日两次;未用利拉鲁肽干预组(NC组,MC组,MC+hUC-MSCs组)皮下注射相应剂量生理盐水,每日两次。2.检测指标及方法:治疗8周末,检测大鼠体重和肝湿重,计算肝指数(Liver index,LI);大鼠血清空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST);ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、超氧化物歧化酶(SOD)和空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色和透射电镜下观察大鼠肝脏组织病理改变;免疫组化法检测大鼠肝脏组织TLR4和NF-κB蛋白表达;RT-PCR法检测大鼠肝脏组织TLR4和NF-κB mRNA的表达。结果:1.治疗8周末大鼠一般指标:与NC组比较,MC组大鼠LI、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL、ALT、AST和HOMA-IR均明显增高(P﹤0.05),HDL降低(P﹤0.05);与MC组比较,三个治疗组大鼠LI、FPG、Hb A1c、TC、TG、LDL、ALT、AST和HOMA-IR均显著降低(P﹤0.05),HDL明显增高(P﹤0.05);与MC+hUC-MSCs组比较,MC+LIRA组和MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠LI、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL、ALT、AST和HOMA-IR均降低更明显(P﹤0.05),HDL增高(P﹤0.05);进一步比较MC+LIRA组和MC+LIRA+hUC-MSCs组,MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠LI、FPG、Hb A1c、TC、TG、LDL、ALT、AST和HOMA-IR均降低(P﹤0.05),HDL增高(P﹤0.05)。2.治疗8周末大鼠血清TNF-α、IL-6、8-OHdG和SOD水平:与NC组比较,MC组大鼠TNF-α、IL-6和8-OHdG均明显增高(P﹤0.05),SOD降低(P﹤0.05);与MC组比较,三个治疗组大鼠TNF-α、IL-6和8-OHdG均明显降低(P﹤0.05),SOD明显增高(P﹤0.05);与MC+hUC-MSCs组比较,MC+LIRA组和MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠TNF-α、IL-6和8-OHdG均降低更明显(P﹤0.05),SOD增高(P﹤0.05);与MC+LIRA组比较,MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠TNF-α、IL-6和8-OHdG均降低(P﹤0.05),SOD增高(P﹤0.05)。3.治疗8周末大鼠肝脏组织病理改变:HE染色光镜下观察大鼠肝脏组织病理改变:NC组大鼠肝组织结构正常;MC组大鼠肝组织见大量空泡脂滴,肝细胞呈重度脂肪变性,细胞核被挤压变形或消失,肝索紊乱,肝小叶可见炎症细胞浸润;MC+hUC-MSCs组和MC+LIRA组大鼠肝细胞脂肪变性程度减轻,脂滴空泡减少,炎症反应减轻;MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠肝组织未见明显脂滴及炎症细胞浸润。NAFLD活动度积分(NAFLD activity score,NAS)结果提示,与NC组比较,MC组大鼠NAS积分显著增高(P﹤0.05);与MC组比较,三个治疗组大鼠NAS积分均明显降低(P﹤0.05);与MC+hUC-MSCs组比较,MC+LIRA组和MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠NAS积分均降低(P﹤0.05);与MC+LIRA组比较,MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠NAS积分更低(P﹤0.05)。透射电镜下观察大鼠肝脏组织病理改变:NC组大鼠肝细胞核大而圆,线粒体数量丰富且结构清晰,内质网排列规则;MC组大鼠肝细胞浆内见大量脂肪滴,细胞核被挤压变形,线粒体结构模糊,内质网明显水肿;MC+hUC-MSCs组和MC+LIRA组大鼠肝细胞内有少量小泡脂肪滴,线粒体结构较清楚,内质网轻度水肿;MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠肝细胞内仅有单个小脂滴,线粒体数量较多且结构清晰,内质网排列整齐,肝细胞形态结构接近正常。4.治疗8周末大鼠肝脏组织TLR4和NF-κB蛋白表达:与NC组比较,MC组大鼠TLR4和NF-κB蛋白表达均明显增高(P﹤0.05);与MC组比较,三个治疗组大鼠TLR4和NF-κB蛋白表达均显著降低(P﹤0.05);与MC+hUC-MSCs组比较,MC+LIRA组和MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠TLR4和NF-κB蛋白表达均降低(P﹤0.05);与MC+LIRA组比较,MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠TLR4和NF-κB蛋白表达更低(P﹤0.05)。5.治疗8周末大鼠肝脏组织TLR4和NF-κB mRNA表达:与NC组比较,MC组大鼠TLR4和NF-κB mRNA表达均显著增高(P﹤0.05);与MC组比较,三个治疗组大鼠TLR4和NF-κB mRNA表达均明显降低(P﹤0.05);与MC+hUC-MSCs组比较,MC+LIRA组和MC+LIRA+hUC-MSCs组大鼠TLR4和NF-κB mRNA表达均降低(P﹤0.05);与MC+LIRA组比较,MC+LIRA+hUCMSCs组大鼠TLR4和NF-κB mRNA表达更低(P﹤0.05)。6.相关分析:(1)大鼠血清ALT、AST与血清TNF-α、IL-6和8-OHdG的水平均呈正相关(分别为r=0.936,0.953,0.915;r=0.93,0.959,0.912;均P﹤0.01);与血清SOD的水平均呈负相关(分别为r=-0.961;r=-0.953;均P﹤0.01);与大鼠肝组织TLR4和NF-κB mRNA的水平均呈正相关(分别为r=0.908,0.948;r=0.907,0.939;均P﹤0.01)。(2)大鼠肝组织NAS积分与血清TNF-α、IL-6和8-OHdG的水平均呈正相关(r=0.946,0.939,0.9,P﹤0.01);与SOD的水平呈负相关(r=-0.949,P﹤0.01);与大鼠肝组织TLR4和NF-κB mRNA的水平均呈正相关(r=0.969,0.954,P﹤0.01)。结论:1.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病大鼠的糖脂代谢及肝脏损伤与炎症反应和氧化应激密切相关;2.利拉鲁肽或脐带间充质干细胞单一以及两者联合干预对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗和肝脏损伤均有不同程度的改善作用;3.与利拉鲁肽或脐带间充质干细胞单一干预相比较,两者联合干预对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗和肝脏损伤的改善作用效果更佳;4.利拉鲁肽联合脐带间充质干细胞对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病大鼠的作用机制可能与其下调了TLR4/NF-κB炎症通路及氧化应激相关。