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氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)具有丰富的生物活性,在医药和食品等多个领域得到广泛应用。目前GlcN的生产方法有酸水解法、微生物发酵法和生物催化法。传统的甲壳素酸水解法是GlcN工业化生产的主要途径,但该方法在原料来源、环境保护以及产品安全等方面存在不足。通过微生物发酵法制备N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-Glucosamine,GlcNAc),进一步脱乙酰基获得GlcN近年来已逐渐成为GlcN规模化生物制造的主要途径,然而该方法仍需要再将GlcNAc水解脱乙酰基生成GlcN,过程消耗大量浓酸,极易造成设备腐蚀,且严重污染环境。针对上述问题,本研究旨在发掘高效的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶,探索GlcNAc的酶法脱乙酰途径,从而取代目前的酸水解脱乙酰法,为实现GlcN的全链条绿色生物制造提供基础。首先,利用生物信息学手段从数据库中筛选得到了 6个不同来源(Thermococcus kodakarensis、Thermococcusprofundus、Thermococcus siculi、Thermococcus sp.2319x1、Thermococcus celericrescens 和Cyclobacterium qasimii)的具有潜在 N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性的蛋白质序列(TkDac、TpDac、TsDac、TspDac、TcDac和CqCBDA)。将筛选获得的基因通过大肠杆菌表达系统异源重组表达,其中TpDac、TcDac和CqCBDA诱导表达得到可溶性重组蛋白。将这3个重组酶用Ni亲和层析柱纯化,并对其进行酶学性质表征。结果表明:3种重组脱乙酰酶均具有N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性,TpDac、TcDac和CqCBDA的最适pH分别为8.0、8.8和7.6,最适反应温度分别为80℃、75℃和40℃;在最适条件下,以GlcNAc为底物,其比酶活分别为 271.8 U/mg、179.7 U/mg 和 9.6 U/mg。其次,选择酶活高且表达量高的重组脱乙酰酶TcDac,探索了 GlcNAc的酶法脱乙酰应用潜力。结果表明:在底物GlcNAc浓度为40 g/L,反应温度为50℃的条件下,TcDac催化反应1.5 h,GlcN的含量可达28.0 g/L,此时GlcNAc的转化率为95.4%;在底物GlcNAc浓度为60 g/L,反应温度为30℃的条件下,TcDac催化反应2.5 h,GlcN的含量可达44.4 g/L,此时GlcNAc的转化率为88.9%。底物GlcNAc的初始浓度越低,转化率越高,但GlcN产量较低;温度越低,GlcN的损失越少,但反应消耗时间较长。上述实验获得的TcDac催化GlcNAc脱乙酰基生产GlcN的最佳应用条件为:底物浓度40～60 g/L,反应温度30～40℃,pH 7.5～8.0,反应时间1～2.5h。综上,本研究筛选获得了 3种具有N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性的新型脱乙酰酶。其中TcDac表达量高、比酶活高、催化转化率高并且稳定性好,具有较好的应用于GlcN的酶法规模化生产的潜力,研究结果为酶法绿色制备GlcN相关研究提供了基础。