丝状真菌（Filamentous fungi）和大肠杆菌等原核表达系统和酵母相比，丝状真菌具有蛋白分泌能力强，同源蛋白胞外效率高、表达同源蛋白量大、表达蛋白具有天然活性高蛋白修饰翻译加工模式接近高等真核生物等一系列优点和优势。黑曲霉菌株被美国FDA和世界卫生组织认定为一般安全可靠无毒的（Generally regarded as safe , GRAS）微生物。作为细胞工厂，大量用于酶制剂制备、同源蛋白生产、有机酸生产、抗原生产等一些生产领域当中。不同菌株具有的产酶特性也有明显差别，本实验室分离得到的黑曲霉菌株 ANSTJ01 具有高产纤维素酶活性，能够降解赭曲霉毒素 A。该菌株在畜牧业生产中的开发利用受到普遍的关注，但是对黑曲霉培养物的安全性研究报道比较少，为了保证人畜的安全需要对该菌株进行安全性评价。构建黑曲霉菌株为载体的外分泌及表面展示系统能在畜牧生产中对疫苗的研发提供了一个新的研究方向。本实验室在实验室分离得到黑曲霉 ANSTJ01，在评价了该菌株的生物安全性基础上，构建了该菌株的EtMIC2蛋白的外分泌表达与表面展示系统，并对阳性菌株进行了发酵C源的优化。具体研究如下：　　1.黑曲霉ANSTJ01菌株的生物安全性评价　　为评价该菌株对雏鸡是否安全，以海兰褐雏鸡为试验对象，对黑曲霉培养物进行安全性评价。包括死亡率，血常规检测，组织切片，肠道检测等方面进行判定。该菌株在试验期内不能导致试验雏鸡死亡，血常规无异常，组织切片中未发现菌丝，肠道未导致病变。试验期内该菌株不能对海兰褐雏鸡产生致病性。　　2.黑曲霉外分泌及表面展示系统的构建及转染条件优化　　为筛选该菌株的筛选标记，将本实验室分离得到的黑曲霉菌株进行了抗生素筛选根据不同浓度，不同抗生素重复筛选技术。在YTD固体培养基下，30℃静态培养，实验结果显示200μg/mL潮霉素的效果最为明显可以作为遗传标记筛选。　　使用国际公认的黑曲霉强启动子 PglaA(扩增于实验室分离得到的黑曲霉菌株)。将曲霉菌株的外分泌信号肽：GlaA singal，以及Hyg基因片段等与PglaA整合，成功构建目的质粒并命名为PPshD。将本实验保存并克隆于的EtMIC2基因，连入本实验室构建的 PPSHD-GFP 目的质粒中。得到阳性菌株并命名为 PPSHD-GFP-EtMIC2。同时在EtMIC2基因片段前加入CBM锚定蛋白基因片段构建质粒PPSHD-CBM-EtMIC2。　　为提高原生质体产量，改变黑曲霉菌丝生长培养基及生长条件：培养12h 在含有0.5%的玻璃纸培养基中；优化原生质体裂解酶系：使用配置混合酶系。大量提高黑曲霉原生质体产量。利用原生质体Ca2+转化技术，分别转染制备的瞬时质粒与同源重组线性化片段至黑曲霉菌株中，结果显示，瞬时质粒转化的阳性率达到83%，同源重组的转化效率达到48%，明显低于瞬时质粒转化效率，但是瞬时质粒阳性菌株为基因随机插入，而同源重组片段插入为定点插入。　　为增加目的蛋白的产量，通过改变碳源，改变发酵温度等条件成功优化了黑曲霉菌株发酵条件，增加了目的基因蛋白的表达量。其中48h 时菌丝荧光强度麦芽糖发酵液的菌丝荧光>葡萄糖发酵液的荧光>纤维二糖发酵液>微晶纤维素发酵液。通过Western-blot检测及灰度值分析表明麦芽糖浓度10g/L中的发酵条件为最优。　　在本研究中，我们将 EtMIC2 基因成功克隆出并成功连入本实验室成功构建的PPshD-GFP及PPshD-CBM表达质粒中。构建黑曲霉外分泌质粒PPshD-GFP-MIC2及表面展示质粒PPshD-CBM-MIC2。将目的质粒通过AvrII限制性酶切酶将目的质粒线性化后，通过原生质体转染技术，将目的基因片段成功转染至黑曲霉菌体中，通过同源重组技术将目的基因重组至基因组中的固定位点。通过 PCR 技术筛选阳性菌株，通过荧光显微镜技术检测到目的基因成功表达。通过IFA检测表面展示的目蛋白，成功构建黑曲霉表面展示系统。后期通过改变发酵条件增加异源蛋白的表达产量，通过 Western-blot技术成功验证目的蛋白的表达量提高。