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目的:目前脑梗死最有效治疗方法是超早期溶栓,但须在4.5h时间窗内实施,否则极易破坏血脑屏障(BBB)而出现脑水肿及颅内溶栓出血性转化等并发症,导致死亡率增高,如能探寻到延长时间窗的方法,将会为患者赢得更多救治机会。针刺治疗脑梗死的疗效公认,然而早期针刺能否提高溶栓安全性,进而延长脑梗死溶栓时间窗,目前尚不明确。因此,本研究首先明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应,其次从细胞与分子水平探讨针刺提高脑梗死溶栓安全性、延长溶栓时间窗的作用机制。方法:本研究采用“醒脑开窍”针刺法,以改良的自体血栓栓塞性脑缺血模型为研究对象,rtPA为静脉溶栓手段。实验一:将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、4.5h溶栓组、6h溶栓组、9h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组、针刺+9h溶栓组。观察针刺干预对各组大鼠梗死体积、神经行为学评分、BBB通透性、颅内溶栓出血性转化及脑水肿的影响,以明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应。实验二:将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、6h溶栓组、针刺+6h溶栓组。采用Western blot、免疫荧光(IF)检测ERK1/2信号通路指标(MEK1/2、ERK1/2)、跨膜蛋白(Claudin5)、胞浆黏附蛋白(ZO-1)、细胞骨架蛋白(MAP-2)以及MMP9的蛋白表达;采用 Real time-PCR、Western blot 检测 NF-κB p65 的 mRNA 及蛋白表达;使用透射电镜观察各组BBB超微结构的变化;采用ELISA法检测缺血脑组织中炎症因子(TNF-α、IL-1β)的含量。实验三:将SD大鼠随机分为假手术组、6h溶栓组、6h溶栓组+ERK1/2信号通路抑制剂(U0126)组。采用Western blot检测ERK1/2、MMP9、NF-κB p65的蛋白表达变化。通过实验二、三,明确针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗的作用机制。结果:1、各组大鼠神经行为学评分的比较治疗后24h评分,与模型组相比,4.5h溶栓组神经行为学评分降低,差异有统计学意义(P<0.01)。时间窗外溶栓组(6h溶栓组、9h溶栓组)与模型组相比,神经行为学评分差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组、6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组神经行为学评分均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明针刺可改善时间窗外溶栓大鼠的神经行为学评分。2、各组大鼠脑梗死体积的比较与模型组相比,4.5h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组脑梗死体积显著减小(P<0.01);6h溶栓组、9h溶栓组、针刺+9h溶栓组比模型组脑梗死体积显著增大(P<0.01,P<0.05);针刺+6h溶栓组与6h溶栓组比,梗死体积显著减小(P<0.01)。表明针刺可减小时间窗外溶栓大鼠的脑梗死体积。3、各组大鼠脑出血性转化的比较与模型组相比较,6h溶栓组、9h溶栓组、针刺+9h溶栓组血红蛋白含量均显著升高(P<0.01),说明超时间窗外溶栓会显著增加出血性转化风险。针刺+6h溶栓与6h溶栓比,血红蛋白含量降低(P<0.05)。表明针刺可降低时间窗外单纯溶栓大鼠的脑出血性转化。4、各组大鼠BBB通透性的比较与模型组相比,时间窗内4.5h溶栓组Evans blue(EB)含量降低;时间窗外6h、9h溶栓组EB含量增加,其差异均具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组EB含量降低;针刺+9h溶栓组EB含量增加,其差异均具有统计学意义(P<0.01)。针刺+6h溶栓与6h溶栓比,EB含量降低(P<0.05)。表明针刺可降低时间窗外单纯溶栓大鼠的BBB通透性。5、各组大鼠脑含水量的比较与模型组相比,4.5h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组脑含水量均显著降低(P<0.01);时间窗外6h溶栓组、9h溶栓组脑含水量显著增加(P<0.01)。针刺+6h溶栓组与6h溶栓组比,脑含水量显著降低(P<0.01)。表明针刺可降低时间窗外溶栓大鼠的脑含水量。6、各组大鼠BBB超微结构的改变透射电镜显示:模型组BBB超微结构内皮细胞及基底膜明显肿胀变形且不规则,内皮细胞层间连接疏松,紧密连接遭到破坏。6h溶栓组BBB脑微血管内皮细胞及基底膜肿胀变形进一步加重,大量空泡及胞饮小泡形成,紧密连接断裂,BBB超微结构严重破坏。针刺+6h溶栓组BBB超微结构破坏减轻,其内皮细胞及基底膜肿胀减轻,形态有规则基本连续完整,紧密连接破坏明显减轻,表明针刺可改善脑梗死溶栓大鼠BBB超微结构的破坏。7、针刺对脑梗死溶栓大鼠ERK1/2信号通路的作用WB、IF结果显示:模型组与假手术比,p-MEK1/2/t-MEK1/2、p-ERK1/2/t-ERK1/2均显著增加(P<0.01);针刺+6h溶栓组分别与6h溶栓组、模型组相比,p-MEK1/2/t-MEK1/2、p-ERK1/2/t-ERK1/2均显著降低(P<0.0 1)。表明针刺可抑制时间窗外溶栓大鼠E Rκ1/2信号通路的激活。8、各组大鼠MMP9的表达比较WB、IF结果显示:与假手术相比,模型组MMP9表达增加(P<0.01);6h溶栓组与模型组比,MMP9进一步增加(P<0.05);针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,MMP9表达显著降低(P<0.01)。提示针刺可下调时间窗外溶栓大鼠MMP9的蛋白表达。9、各组大鼠ZO-1、Claudin5、MAP-2的表达比较WB、IF结果显示:与假手术相比,模型组ZO-1、Claudin5、MAP-2蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.01);6h溶栓组与模型组比,ZO-1、Claudin5、MAP-2的表达进一步降低(P<0.05);针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,ZO-1、Claudin5、MAP-2蛋白表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。提示针刺可上调时间窗外溶栓大鼠ZO-1、Claudin5、MAP-2 的蛋白表达。10、各组大鼠NF-κB p65的表达比较WB、RT-PCR结果显示:与假手术相比,模型组NF-κB p65mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01);6h溶栓组与模型组比,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平进一步升高(P<0.01);针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。表明针刺可下调时间窗外溶栓大鼠NF-κB p65的mRNA和蛋白表达水平。11、各组大鼠TNF-α和IL-1β的含量比较ELISA结果显示:与假手术相比,模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1 β含量显著升高(P<0.01);6h溶栓组与模型组比,TNF-α、IL-1β含量进一步升高(P<0.01);针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,TNF-α、IL-1 β含量显著降低(P<0.01)。表明针刺可降低时间窗外溶栓大鼠脑组织炎症因子TNF-α和IL-1 β的含量。12、ERK1/2信号通路对MMP9、NF-κB p65表达的影响WB结果显示:与假手术相比,6h溶栓组p-ERK1/2、MMP9、p-NF-κB p65表达均显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01);与6h溶栓组比,6h溶栓+U0126组大鼠p-ERK1/2、MMP9、p-NF-κB p65表达均显著降低(P<0.01)。表明ERK1/2信号通路位于MMP9、NF-κB p65的上游,能够调控其蛋白表达水平。结论:1、针刺及时介入,能够减轻溶栓并发症,提高溶栓安全性,发挥延长脑梗死溶栓时间窗的效应,本实验研究表明,针刺可延长该安全时间窗至6h。2、针刺能够抑制ERK1/2信号通路的激活,进而下调MMP9以及NF-κB p65的表达,上调大鼠血脑屏障结构相关蛋白(Claudin5、ZO-1、MAP-2)的表达,并降低脑组织中炎症因子(TNF-α、IL-1 β)的含量,改善血脑屏障的破坏,表明针刺是通过调控ERK1/2信号通路来实现延长脑梗死溶栓时间窗效应的。