论文部分内容阅读
[目的]特发性炎性肌病(ⅡM)是一种病因和发病机制均未十分清楚的系统性自身免疫病,临床上以多发性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)最常见。众多研究提示免疫反应的异常可能是ⅡM发生、发展的中心环节,研究淋巴细胞表型和功能的异常对深入了解ⅡM的发病机制有重要意义。同时,既往研究证实ⅡM疾病活动性与外周淋巴细胞亚群存在一定关系。本研究主要分为两个部分：第一部分探讨外周血淋巴细胞亚群异常在PM和DM中的临床意义,以及检测外周血淋巴细胞亚群在ⅡM中的临床应用价值；第二部分是研究ⅡM患者外周血T淋巴细胞自噬现象的异常,希望可以为ⅡM发病机制的理论研究提供一些线索。[方法]第一部分是用流式细胞仪检测89例PM/DM患者外周血淋巴细胞标记分子的表达情况,比较初治患者及病情缓解患者以及部分患者自身治疗前后外周血淋巴细胞亚群的区别,并通过多因素回归分析分析淋巴细胞亚群变化与疾病临床特点之间的关系。第二部分用免疫磁珠法分离10例DM患者和9例健康对照外周血T淋巴细胞,部分样本直接经免疫印迹法检测自噬蛋白LC3和Beclin1的表达,并在透射电镜和荧光显微镜下观察细胞自噬现象；部份样本经过培养刺激之后检测自噬蛋白的表达。最后使用不同浓度的TRAIL或TNFa刺激人Jurkat T细胞,免疫印迹法、流式细胞术及CCK-8法分别检测细胞自噬蛋白的表达、凋亡情况和增殖活性。[结果]第一部分：流式细胞仪检测表明初治并处于活动期的DM患者外周血CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞计数(分别为848.7±446.6,534.8±279.8和257.2±157.9cell/mm3)明显低于DM非活动期患者(1632.4±622.5,1041.8±558.2和562.5±376.2cell/mm3)和健康对照(1376.3±389.7,834.4±278.6和457.9±170.4cell/mm3)(F=12.901,8.257,7.084;P值均<0.05)。6例患者经过治疗后病情均有不同程度的缓解,随访检测了外周血淋巴细胞亚群,其中CD3+和CD3+CD4+细胞计数在治疗前分别为514.0±412.1cell/mm3和255.0±127.0cell/mm3,治疗后升高为833.5±470.5cell/mm3和449.2±146.0cell/mm3,治疗前后比较差异均具有统计学意义(t=-5.714和-3.665；P值均<0.05)。多因素Logistic回归分析发现,PM/DM患者肌炎活动视觉模拟评估工具-疾病总活动度评分是患者外周血CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞计数减低的独立影响因素(b=0.211,0.344,0.289；P值均<0.05)；合并问质性肺疾病(ILD)是CD3+细胞计数减低及CD3+CD4+细胞百分比减低的独立影响因素(b=0.928,1.974；P值均<0.05)。另外Logistic回归分析发现,CD3+CD8+细胞计数是PM/DM死亡的独立危险因素(b=-0.011,OR=0.989;P<0.05)。第二部分：透射电镜下可以观察到DM患者外周血T细胞典型的自噬体和自噬溶酶体结构形成。未发现健康人及DM患者外周血T细胞有明显自噬标记蛋白LC3的表达,而Beclinl蛋白表达在健康人及DM患者之间比较差别无统计学意义(P>0.05)。经过氯喹培养刺激后,两组实验中每组DM患者外周血T淋巴细胞LC3蛋白表达均高于健康对照。人Jurkat T细胞内LC3蛋白的表达随TNFa刺激浓度的增加没有明显变化,但随着TRAIL浓度增加下调。TRAIL及TNFa均可引起JurkatT细胞发生凋亡的比例增加并抑制细胞增殖活性,该作用随着培养刺激浓度的增加而增强。[结论]第一部分：外周血T淋巴细胞亚群在PM/DM疾病活动期明显异常,并且随着治疗后病情缓解而趋于恢复,可以作为评价PM/DM病情活动的参考指标之一。PM/DM合并ILD可引起T细胞计数和CD4+T细胞百分比减低,对临床综合评估ⅡM肺脏受累可能有重要意义；CD8+T淋巴细胞计数明显降低的患者死亡危险将增加,对评估PM/DM预后亦有指导意义。第二部分：DM患者外周血T淋巴细胞存在自噬现象,DM患者外周血T淋巴细胞自噬的情况可能不同于健康人；不同细胞因子,如TRAIL及TNFa,可能对人Jurkat T细胞自噬具有不同的调节作用。这些发现为ⅡM发病机制的研究提供了新的方向。