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目的:探讨蟾毒灵(Bufalin)调控Na~+-K~+-ATPase活性在抗膀胱肿瘤中的作用及其相关分子机制。方法:1.培养膀胱癌T24细胞株至对数生长期加入蟾毒灵,观察细胞生长状态的变化;2.MTT法检测蟾毒灵对膀胱癌T24细胞增值抑制作用;3.采用荧光定量PCR检测蟾毒灵作用后膀胱癌T24细胞Na~+-K~+-ATPase各亚基(α1、α2、α3)的表达量,并筛选出关键Na~+-K~+-ATPaseα亚基点;4.构建膀胱癌T24Na~+-K~+-ATPase关键亚基沉默慢病毒载体,并转染T24细胞,荧光定量PCR筛选出最佳沉默病毒株;稳转染T24细胞后加入蟾毒灵,再次在细胞生长状态上观察人膀胱癌T24细胞在沉默Na~+-K~+-ATPase关键亚基后的细胞生长状态的改变;5.流式细胞仪检测Na~+-K~+-ATPase关键亚基沉默后蟾毒灵作用于T24细胞凋亡率的改变;结果:1.蟾毒灵对T24细胞具有明显的抑制作用,加入蟾毒灵的T24细胞出现大量凋亡,细胞数量减少,细胞体积变小、变圆,出现皱缩、脱落、悬浮于培养基中;2.应用MTT法检测蟾毒灵对膀胱癌T24细胞增殖抑制作用,结果显示蟾毒灵对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用,随着蟾毒灵浓度的增加,抑制率增加,48h IC50为18.6nmol/L。3.应用荧光定量PCR检测膀胱癌T24细胞Na~+-K~+-ATPaseα1、α2、α3亚基在蟾毒灵48h IC50浓度下的表达量,分别以空白对照组α亚基表达量为1,得出结果如下:T24细胞Na~+-K~+-ATPaseα1的基因的相对表达量为(1.86±0.12);Na~+-K~+-ATPaseα2的基因的相对表达量为(0.94±0.18);Na~+-K~+-ATPaseα3的基因的相对表达量为(14.68±0.56);蟾毒灵作用后,Na~+-K~+-ATPaseα3亚基表达明显升高(P<0.05),α1、α2亚基表达变化不明显,故针对表达差异最显著的Na~+-K~+-ATPaseα3亚基设计shRNA慢病毒载体阻断其表达,并进行下一步功能验证;4.构建膀胱癌T24 Na~+-K~+-ATPase关键亚基沉默慢病毒载体,通过荧光定量PCR筛选最佳沉默效果病毒株,空白对照组、shRNA1、shRNA2、shRNA3、阴性病毒各Na~+-K~+-ATPaseα3亚基RNA的表达量分别为(1.03±0.02)、(0.04±0.01)、(0.85±0.34)、(0.81±0.26)、(0.90±0.02);shRNA1号病毒株Na~+-K~+-ATPaseα3沉默效果最好,沉默量达百分之九十以上,P<0.05,差异有统计学意义,故选择shRNA1号病毒株为阳性干扰序列行后续研究;5.慢病毒载体成功转染T24细胞后,蟾毒灵对T24细胞生长状态的影响明显降低,细胞数量及形态改变随浓度的增加,变化不大;6.流式细胞仪检测蟾毒灵对T24细胞凋亡率的影响,阴性病毒组T24细胞凋亡率为(68.42±1.74)%,而沉默掉Na~+-K~+-ATPaseα3亚基的实验组加入蟾毒灵后T24细胞凋亡率为(28.36±0.42)%,差异有统计学意义,(P<0.05)。结论:蟾毒灵对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用;蟾毒灵抑制膀胱癌T24生长的能力与T24细胞中的Na~+-K~+-ATPaseα3的表达有关。抑制T24细胞Na~+-K~+-ATPaseα3亚基后,蟾毒灵抑制膀胱癌细胞生长能力下降,Na~+-K~+-ATPaseα3亚基是蟾毒灵作用于膀胱癌细胞的一个重要靶点。