乳房炎和牛结核病作为危害奶牛业的重大疾病,会造成奶牛产奶量下降、牛奶品质降低以及治疗费用增加等一系列问题。引起乳房炎和牛结核病的病原体可能通过受污染的未经巴氏消毒的牛奶传播,严重威胁人类身体健康。目前,我国奶牛养殖过程中仍然缺乏可以控制这两种疾病的有效手段。本实验室前期工作表明,插入天然抗性相关性巨噬细胞蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein 1,NRAMP1）基因或小鼠胞内病原体抗性基因1（intracellular pathogen resistance 1,Ipr1）能够提高基因编辑牛对结核病的抗性;人溶菌酶（human Lysozyme,h LYZ）基因定点整合的基因编辑牛可以显著抵抗引起乳房炎的病原体的感染。因此,通过生产相关抗病基因编辑牛为抵抗乳房炎和牛结核病提供了有益思路。然而,这些研究中利用同源定向修复（homology-directed repair,HDR）介导外源基因定点整合的效率较低,限制了基因编辑牛新品种的培育进程。鉴于此,提高外源基因插入效率可以极大地推动基因编辑技术在牛抗病育种中的应用。本研究拟通过优化CRISPR/Cas9系统,进而提高抗病基因定点整合到荷斯坦奶牛基因组上的效率,为生产抗病基因编辑牛及后续扩繁提供技术支持。本研究主要内容如下:1.在牛MS基因座（牛28号染色体上甲硫氨酸腺苷基转移酶IA基因和表面活化蛋白A1基因间区域）和鉴定出的牛ROSA26基因座分别构建一套检测基于同源介导的末端链接（homology-mediated end-joining,HMEJ）、微同源介导的末端连接（microhomology-mediated end-joining,MMEJ）、非同源末端连接（non-homologous end-joining,NHEJ）和HDR策略介导外源基因定点整合的报告系统。比较四种策略介导外源基因插入的效率,结果表明,基于HMEJ的策略在两个基因座中介导的基因定点整合效率显著高于NHEJ、MMEJ和HDR策略。利用ROSA26基因内源启动子启动筛选标记基因表达的方法结合基于HMEJ的策略,高效筛选出外源基因定点整合的阳性细胞,优化了应用于牛胎儿成纤维细胞的基因编辑系统。2.利用慢病毒载体在牛成纤维细胞中构建了一套反映HDR和NHEJ发生频率的红绿灯报告系统。通过报告系统和筛选阳性克隆的方法评估了小分子药物RS-1、SCR7、NU7441对HDR介导的外源基因整合效率的影响。3.利用上述优化的基因编辑系统结合体细胞核移植技术,成功生产了三头NRAMP1基因定点整合的基因编辑牛,并获得了h LYZ基因编辑牛胎儿。利用外源启动子启动筛选标记基因表达的方法结合HMEJ策略,高效筛选出Ipr1基因定点整合的阳性细胞,最终获得了一头抗病基因定点插入且正常表达的基因编辑牛。综上所述,本研究发现基于HMEJ介导的外源基因插入效率显著高于NHEJ、MMEJ和HDR策略;利用基于HMEJ的策略高效介导外源基因定点整合,获得了牛ROSA26基因座抗病基因编辑牛,为牛的抗病育种提供了宝贵材料。