论文部分内容阅读
干细胞的分化不仅遵循生物和化学信号的指示，还遵循机械力指示，如：流体剪切力和基底应力。这两种机械力刺激下干细胞会产生分化，但由这两种机械力刺激触发的即时基因转录调控机制还不明确。
热休克蛋白(HSP)家族，HSP70在应对各种应激(如热应激和氧化应激)时表现出快速和最大的转录增加，表明HSP70蛋白是对抗应激的基本防御措施的一部分。热休克反应也被认为是由压缩载荷引起的，这表明热休克反应可能在感知机械力方面发挥作用。热休克因子1(HSF1)还调节(诱导或抑制)参与其他基因的表达，包括细胞凋亡、蛋白质转运、能量生成等。HSF1是热休克反应的主要调节因子，同样是HSP家族的关键转录激活因子。机械力刺激不仅使HSP70表达增加，同样会使细胞分化。判断在流体剪切力刺激后引起的HSP70的基因与蛋白表达量的变化是否由HSF1进行的调节，HSF1是否在两种机械力刺激BMSCs分化中发挥作用。
本研究报道了HSF1，即急性热应激和氧化应激下基因表达的主要调节因子，在机械力刺激后立即被激活并转运到细胞核，导致转录调控。后续诱导分化实验证明在基底应力刺激BMSCs分化时HSF1具有介导的作用。
目的：研究在流体剪切力和基底应力两种机械力刺激下HSF1对BMSCs分化的影响。
方法：一、分离和鉴定BMSCs。
将新鲜人骨髓血采用密度梯度离心法分离出人骨髓间充质干细胞，培养扩增BMSCs，对第三代BMSCs进行细胞活率检测，采用流式细胞术进行细胞表面标记物鉴定以及通过诱导分化检测BMSCs分化能力。根据数据确定BMSCs是否可以进行后续实验。
二、检测HSP70在流体剪切力刺激BMSCs时的变化。
1.BMSCs分为实验组与对照组，实验组BMSCs转移至培养箱用流动室中进行流体剪切力刺激。对照组仅更换培养基。
2.a.实验组流体剪切力处理1h后，将实验组与对照组分别取样进行QPCR和WesternBlot，检测HSP70基因表达水平以及蛋白表达水平。b.为确定受到流体剪切力刺激后的HSP70的表达上调与HSF1是否有关，采用双荧光素酶报告基因检测BMSCs受到流体剪切力刺激后HSF1启动子HSE的活性变化。实验组与对照组分别进行RL/HSE共染。第二天进行双荧光素酶报告基因检测。
三、观察HSF1在基底应力刺激下的表达情况，探究BMSCs在敲减HSF1后对基底应力诱导分化的影响。
1.细胞免疫荧光观察在软硬基底上培养的BMSCs表达HSF1的情况。软硬基底的基底应力不同，软胶基底应力小，硬胶基底应力大。
2.敲减BMSCs的HSF1，观察BMSCs对基底应力刺激是否受到影响。实验组转染shHSF1，对照组转染一段无义序列，将两组BMSCs分别培养在软硬两种水凝胶上4d，通过免疫荧光观察细胞成骨标志物和神经标志物的表达。分析HSF1在敲减后对基底应力诱导BMSCs分化的影响。
结果：一、1.使用细胞计数仪检测三组细胞，BMSCs活率为95.3%±1.25%，BMSCs活性好。2.流式细胞术结果显示本次实验使用的细胞其表面标记物CD34与CD45的所占比例为0.6%±0.1%和0.3%±0.1%的低表达。表面标记物CD73、CD90和CD105分别为96.6%±0.6%、97.4%±0.5%和95.8%±0.4%的高表达，说明本次实验分离培养的细胞为BMSCs。3.诱导分化实验中，向成脂细胞方向诱导分化的细胞出现大脂滴，向成骨细胞方向诱导分化的细胞有钙结节产生，向成软骨诱导分化的细胞经甲苯胺蓝染色后出现蓝色斑点，以上实验现象说明BMSCs被成功的诱导分化，BMSCs具有分化能力。
二、1.QPCR数据显示，经过流体剪切处理的实验组HSP70基因表达水平高于未经过流体剪切力处理的对照组，实验组HSP70基因的表达水平为对照组的3.76±0.49倍。WB结果显示经过流体剪切力处理的实验组HSP70蛋白表达量高于对照组，为对照组蛋白表达水平的1.51±0.16倍。2.双荧光素酶报告基因结果显示经过流体剪切力处理的实验组HSF1启动子活性同样高于对照组。
三、1.在不同基底应力的软硬基底上培养的BMSCs，经过免疫荧光染色发现HSF1相对集中于细胞核。2.细胞免疫荧光结果显示在基底应力较大的硬胶上培养的BMSC-shHSF1相较BMSC-con成骨标志物表达少，在基底应力较小的软胶上培养的BMSC-shHSF1相较BMSC-con神经标志物表达量少。
结论：BMSCs的检测显示细胞活性、细胞纯度和细胞分化能力都符合后续实验的要求。QPCR以及WB数据显示实验组HSP70表达水平远高于对照组。表明经过流体剪切力刺激1h后，HSP70基因表达增加，蛋白表达量增加，双荧光素酶报告基因结果显示HSF1启动子活性高于实验组，说明流体剪切实验中HSP70的升高很有可能是由HSF1调控产生。基质胶上培养的BMSCs，HSF1向细胞核聚集，说明HSF1确实可能参加了对基底应力刺激的调节。细胞免疫荧光结果显示BMSC-shHSF1在软硬基底上培养一段时间后，其在硬基底上成骨细胞标志物低于BMSC-con，在软基底上神经细胞标志物同样低于BMSC-con，说明在敲减HSF1基因后，BMSCs的分化受到了影响，表明BMSCs接受到机械力刺激后的分化受到了HSF1的调控，在流体剪切力和基底应力两种机械力的刺激下的BMSCs分化，HSF1具有介导的作用。
热休克蛋白(HSP)家族，HSP70在应对各种应激(如热应激和氧化应激)时表现出快速和最大的转录增加，表明HSP70蛋白是对抗应激的基本防御措施的一部分。热休克反应也被认为是由压缩载荷引起的，这表明热休克反应可能在感知机械力方面发挥作用。热休克因子1(HSF1)还调节(诱导或抑制)参与其他基因的表达，包括细胞凋亡、蛋白质转运、能量生成等。HSF1是热休克反应的主要调节因子，同样是HSP家族的关键转录激活因子。机械力刺激不仅使HSP70表达增加，同样会使细胞分化。判断在流体剪切力刺激后引起的HSP70的基因与蛋白表达量的变化是否由HSF1进行的调节，HSF1是否在两种机械力刺激BMSCs分化中发挥作用。
本研究报道了HSF1，即急性热应激和氧化应激下基因表达的主要调节因子，在机械力刺激后立即被激活并转运到细胞核，导致转录调控。后续诱导分化实验证明在基底应力刺激BMSCs分化时HSF1具有介导的作用。
目的：研究在流体剪切力和基底应力两种机械力刺激下HSF1对BMSCs分化的影响。
方法：一、分离和鉴定BMSCs。
将新鲜人骨髓血采用密度梯度离心法分离出人骨髓间充质干细胞，培养扩增BMSCs，对第三代BMSCs进行细胞活率检测，采用流式细胞术进行细胞表面标记物鉴定以及通过诱导分化检测BMSCs分化能力。根据数据确定BMSCs是否可以进行后续实验。
二、检测HSP70在流体剪切力刺激BMSCs时的变化。
1.BMSCs分为实验组与对照组，实验组BMSCs转移至培养箱用流动室中进行流体剪切力刺激。对照组仅更换培养基。
2.a.实验组流体剪切力处理1h后，将实验组与对照组分别取样进行QPCR和WesternBlot，检测HSP70基因表达水平以及蛋白表达水平。b.为确定受到流体剪切力刺激后的HSP70的表达上调与HSF1是否有关，采用双荧光素酶报告基因检测BMSCs受到流体剪切力刺激后HSF1启动子HSE的活性变化。实验组与对照组分别进行RL/HSE共染。第二天进行双荧光素酶报告基因检测。
三、观察HSF1在基底应力刺激下的表达情况，探究BMSCs在敲减HSF1后对基底应力诱导分化的影响。
1.细胞免疫荧光观察在软硬基底上培养的BMSCs表达HSF1的情况。软硬基底的基底应力不同，软胶基底应力小，硬胶基底应力大。
2.敲减BMSCs的HSF1，观察BMSCs对基底应力刺激是否受到影响。实验组转染shHSF1，对照组转染一段无义序列，将两组BMSCs分别培养在软硬两种水凝胶上4d，通过免疫荧光观察细胞成骨标志物和神经标志物的表达。分析HSF1在敲减后对基底应力诱导BMSCs分化的影响。
结果：一、1.使用细胞计数仪检测三组细胞，BMSCs活率为95.3%±1.25%，BMSCs活性好。2.流式细胞术结果显示本次实验使用的细胞其表面标记物CD34与CD45的所占比例为0.6%±0.1%和0.3%±0.1%的低表达。表面标记物CD73、CD90和CD105分别为96.6%±0.6%、97.4%±0.5%和95.8%±0.4%的高表达，说明本次实验分离培养的细胞为BMSCs。3.诱导分化实验中，向成脂细胞方向诱导分化的细胞出现大脂滴，向成骨细胞方向诱导分化的细胞有钙结节产生，向成软骨诱导分化的细胞经甲苯胺蓝染色后出现蓝色斑点，以上实验现象说明BMSCs被成功的诱导分化，BMSCs具有分化能力。
二、1.QPCR数据显示，经过流体剪切处理的实验组HSP70基因表达水平高于未经过流体剪切力处理的对照组，实验组HSP70基因的表达水平为对照组的3.76±0.49倍。WB结果显示经过流体剪切力处理的实验组HSP70蛋白表达量高于对照组，为对照组蛋白表达水平的1.51±0.16倍。2.双荧光素酶报告基因结果显示经过流体剪切力处理的实验组HSF1启动子活性同样高于对照组。
三、1.在不同基底应力的软硬基底上培养的BMSCs，经过免疫荧光染色发现HSF1相对集中于细胞核。2.细胞免疫荧光结果显示在基底应力较大的硬胶上培养的BMSC-shHSF1相较BMSC-con成骨标志物表达少，在基底应力较小的软胶上培养的BMSC-shHSF1相较BMSC-con神经标志物表达量少。
结论：BMSCs的检测显示细胞活性、细胞纯度和细胞分化能力都符合后续实验的要求。QPCR以及WB数据显示实验组HSP70表达水平远高于对照组。表明经过流体剪切力刺激1h后，HSP70基因表达增加，蛋白表达量增加，双荧光素酶报告基因结果显示HSF1启动子活性高于实验组，说明流体剪切实验中HSP70的升高很有可能是由HSF1调控产生。基质胶上培养的BMSCs，HSF1向细胞核聚集，说明HSF1确实可能参加了对基底应力刺激的调节。细胞免疫荧光结果显示BMSC-shHSF1在软硬基底上培养一段时间后，其在硬基底上成骨细胞标志物低于BMSC-con，在软基底上神经细胞标志物同样低于BMSC-con，说明在敲减HSF1基因后，BMSCs的分化受到了影响，表明BMSCs接受到机械力刺激后的分化受到了HSF1的调控，在流体剪切力和基底应力两种机械力的刺激下的BMSCs分化，HSF1具有介导的作用。