论文部分内容阅读
随着越来越多的转基因作物及其制品进入市场,势必会对其安全监管体系提出更高的要求。近年来恒温核酸扩增技术的快速发展促进了RPA扩增技术在转基因检测中的应用,RPA技术良好的性能、简单的操作、便捷的设备、低廉的价格,迅速引起高度关注及开发研究热潮,可以真正实现便携式的检测设备。本实验旨在利用实时荧光RPA扩增技术建立转基因作物及其产品快速检测,并为其他检测体系的建立提供参考。本研究主要有以下三部分实验构成:实验一为了实现对转基因作物及产品的初步快速筛查,通过ISAAA Briefs发布的数据分析,挑选出4种应用最广泛的转基因通用元件CaMV35s、BT、NOS、PAT,根据转基因通用元件特异性序列设计引物与探针,结合冻干粉技术建立6连管实时荧光RPA快速筛查体系。该体系具有较高的特异性和灵敏度,能有效的检出最低48拷贝数的模板。对实际样品的筛查中,筛查结果稳定可靠,在转基因成分检测中具有广泛的应用价值。实验二为了实现对转基因大豆MON89788品系检测,根据其转化体特异性序列设计引物与探针,建立了转基因大豆MON89788的RPA实时荧光检测方法,并就影响RPA扩增的关键因子,如最佳引物的筛选、引物与探针终浓度的配制、反应温度等进行了系统研究分析。该检测方法特异性强,对MON89788的绝对检测限达到40拷贝,相对检测限为0.05%。实验三根据转基因玉米品系MON863转化体特异性序列设计了引物与探针,建立了转基因大豆MON863的RPA实时荧光检测方法,测试不同的反应温度和探针和引物的浓度,优化出了最佳反应条件。使用便携式仪器实时监测RPA的荧光。通过实时RPA结合基于NaOH的DNA提取方法来省略纯化步骤直接扩增来自粗细胞裂解物的游离DNA提取物,并且实时显示扩增结果,并与RT-PCR检测的结果和检测耗时比较,其中两种方法的检测结果一致,RT-RPA的平均检测时间为8.46分钟,RT-PCR的平均检测时间为37.23。与RT-PCR相比,RT-RPA花费的时间要少得多。包括1分钟的准备样品,RT-RPA整个检测过程大约10分钟。综上所述,基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术建立的快速检测方法,表现出高度准确性和特异性,耗时短、操作简单,该方法不仅适用于转基因成分的现场筛选,在其他诸多领域同样具有很大的应用潜力。