研究背景卵巢癌(上皮性癌)是当前病死率最高的妇科恶性肿瘤之一。近年来卵巢癌的治疗有了长足发展,在满意的肿瘤细胞减灭术基础上辅以铂类和紫杉醇为主的联合化疗的治疗策略虽然改善了初治卵巢癌的预后,但其总体生存率仍无明显改善,晚期卵巢癌5年生存率仍徘徊在30%左右。究其根源,肿瘤原发或化疗后的获得性耐药是治疗失败的主要原因之一。因此,逆转耐药对提高患者生存率、改善预后有着重要的临床意义。肿瘤的耐药与多种因素相关,如肿瘤基因的扩增、易位、缺失或突变等,而表观遗传学同样在化疗耐药形成的过程中发挥着重要作用。作为表观遗传的重要机制之一,基因启动子中CpG岛的甲基化是细胞中必不可少的一种修饰方式,是目前最为前沿及研究最多的表观遗传学机制。肿瘤细胞中甲基化状态的改变可以引起整体甲基化状态降低亦或局部甲基化程度增高,进而导致肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。一些相关基因如促药物外排基因启动子甲基化程度的降低可诱导耐药的产生,而由抑癌基因启动子的过度甲基化所致的基因沉默(gene silencing)则可最终导致耐药性的产生。转化生长因子β诱导基因(transforming growth factor β induced gene,TGFBI),又被称为βig-H3基因(TGF-β induce gene, colone3, βig-H3),最早是在TGF-β刺激的肺腺癌细胞株A549中克隆得到的。作为细胞外基质分子之一的TGFBI,最先被关注的是其调节细胞粘附和迁移的功能。随着研究的深入人们发现,TGFBI在正常细胞或永生化细胞系中表达水平上调,但在许多肿瘤组织中表现为表达水平下降或表达沉默,自此开始了对其作为肿瘤抑制基因的功能研究。近年来的研究发现在肺癌和前列腺癌等多种肿瘤中都存在TGFBI的启动子甲基化状态,此外最新的研究显示,在卵巢癌中也检测到了TGFBI启动子区的高甲基化。目前还未有研究就TGFBI基因启动子区的高甲基化状态是否与卵巢癌化疗耐药相关进行过探讨,鉴于此,本课题拟通过检测卵巢癌组织及细胞系中TGFBI的甲基化程度及表达水平,对照卵巢癌耐药细胞系及其对应敏感株中TGFBI甲基化状态及表达水平的不同,探讨卵巢癌中TGFBI甲基化状态与肿瘤耐药的相关性。目的：检测上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中TGFBI启动子区的甲基化状态及其mRNA、蛋白表达情况,分析TGFBI异常甲基化与其表达的相关性及其与卵巢癌临床分期、组织分级、病理类型等特征间的关系,初步探讨TGFBI启动子区甲基化在卵巢癌分子发病中的作用。方法：本研究采用RT-PCR及免疫组化方法检测正常卵巢、良性卵巢肿瘤及卵巢癌组织中TGFBI的表达情况,并通过甲基化特异性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)及亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisufite genomic sequencing, BGS)检测不同组织中TGFBI启动子区的甲基化状态。结果：1.在全部正常卵巢及良性卵巢肿瘤组织中均检测到TGFBI mRNA表达,阳性表达率为100%(10/10),而在卵巢癌组织中TGFBI的表达率明显下降,仅为30%(12/40)。卵巢癌组织与正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织中TGFBI表达存在显著差异(χ2=3.9474,p<0.05)。2.10例正常卵巢组织及10例良性卵巢肿瘤组织中,均检测到TGFBI蛋白表达,且均呈现强阳性(2+或3+),相反,在40例卵巢癌组织中,TGFBI蛋白表达缺如或呈现低表达(0或1+)。卵巢癌组织中TGFBI蛋白表达水平与正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织间存在显著的统计学差异(χ2=50,p<0.01)。3.卵巢癌组织中72.5%(29/40)的组织存在TGFBI甲基化,卵巢良性肿瘤中仅10%(1/10)检测到TGFBI基因甲基化,而在正常卵巢组织却没有发现此现象,三组之间差异显著(χ2=24.5,p<0.01)。4. TGFBI启动子区甲基化阴性的组织其表达率较高,为90.91%(10/11),而存在启动子区甲基化的组织中表达率仅为6.90%(2/29),其间表达存在显著性差异(χ2=7.8108,p<0.01)。5. TGFBI启动子区的甲基化程度与这些临床病理特征均无明显相关性,但随着手术病理分期的进展以及组织病理学分级的增高,TGFBI的甲基化程度有明显升高的趋势。结论：TGFBI在上皮性卵巢癌组织中低表达或表达缺失。TGFBI启动子区CpG岛的高甲基化是上皮性卵巢癌中的频发事件,它是卵巢癌中TGFBI低表达或表达缺失的重要原因,在卵巢癌的发生过发展中发挥着重要作用。TGFBI的高甲基化可作为表观遗传学标记物。目的：拟通过MSP及BGS方法联合检测卵巢癌紫杉醇敏感株及耐药株中TGFBI启动子区甲基化水平,应用去甲基化试剂5-aza-dc作用于细胞系,分析去甲基化作用前后TGFBI表达水平的改变,以及对细胞增殖的影响,初步分析TGFBI甲基化状态与上皮性卵巢癌化疗耐药的相关性,讨论卵巢癌耐药的可能机制及其治疗策略。方法：本研究采用实时荧光定量PCR及Western Blotting方法检测去甲基化药物作用前后TGFBI表达；MSP及BGS法联合检测6种上皮性卵巢癌细胞系中TGFBI启动子区甲基化状态；MTT法检测去甲基化药物作用前后的细胞增殖及迁移能力的改变。结果：1.紫杉醇耐药株SKOV3/TR和A2780/TR表现为完全甲基化状态(M),其余细胞株则表现为混合甲基化状态(M+U)。敏感株与对应耐药株间的甲基化率检测差异显著,具有统计学意义,SKOV3/TR(94.3%)与SKOV3(42.9%)(χ2=64.43,p<0.01),A2780/TR(91.4%)及A2780(35.2%)(χ2=71.38,p<0.01)。2.紫杉醇耐药细胞株中TGFBI呈完全甲基化状态,去甲基化药物可以使其部分至全部去甲基化。去甲基化药物作用后TGFBI在紫杉醇耐药细胞中表达显著增高,SKOV3/TR(7.8±0.9vs.0,P<0.001)以及A2780/TR(6.4±0.2vs.0,P<0.001)；而在其它细胞系中用药后虽有表达升高,但无显著差异。Western Blotting方法对两对敏感株及耐药株用药前后的TGFBI蛋白表达进行了检测,结果与其mRNA表达相吻合。3.1Ommol/L5-aza-dc处理96h后,紫杉醇耐药株SKOV3/TR及A2780不同浓度紫杉醇(0.01、0.1、1、10μM)处理下的抑制率均高于对照组细胞,差异有统计学意义,SKOV3/TR(0.19±0.01μM vs.0.42±0.02μM,P=0.001)及A2780(0.012±0.0001μM vs.0.33±0.011μM,P=0.001)的IC50值均较对照组有显著差异。结论：卵巢癌细胞系中均检测出TGFBI启动子区甲基化状态,应用去甲基化药物5-aza-dc可使TGFBI重新表达或表达升高,说明甲基化是导致卵巢癌细胞系中TGFBI表达缺失或降低的重要原因之一。去甲基化作用可以增强细胞系对紫杉醇的敏感性,认为TGFBI甲基化与卵巢癌紫杉醇耐药相关,并可作为新的治疗靶点。