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结直肠癌是世界范围内的恶性肿瘤之一,其发病率位列所有恶性肿瘤的第四位,死亡率则位列所有恶性肿瘤的第二位,严重威胁着人类的健康,其中结直肠癌的转移是众多结直肠癌患者重要的致死因素之一。随着生活节奏的加快以及饮食结构的改变,结直肠癌的发病逐渐出现普遍化、年轻化的趋势。目前结直肠癌及其转移癌的治疗手段主要以手术切除配合放疗、化疗为主,并且在临床上取得了一定的疗效。然而许多结直肠癌患者的病情状况并不满足手术切除的条件,加之放疗、化疗所带来的副作用对患者的伤害很大,因此,如何拓展结直肠癌相关疾病的治疗手段以及减轻化疗、放疗给患者带来的痛苦是医学界亟待解决的问题。祖国传统中医药是世界医学的重要组成部分。经过几千年用药经验的积累,中医药已经形成了其独特的医学理论体系。利用中医药理论方法来治疗癌症及其转移癌获得了很大的成功。许多中药复方、单味药以及活性单体都显示出了强大的抗肿瘤及抗肿瘤转移的功效。因此,探索出中药治疗癌症及其转移癌的药效物质基础尤为关键。中药冬凌草又称冰凌草,是唇形科香茶属多年生草本或亚灌木,小灌木类植物,为中医临床上的一味常用中草药,其性微寒,味苦、甘,归肺、胃、肝经,具有清热解毒、活血止痛之功效,有着良好的抗菌、抗肿瘤及解热降噪的作用。目前已有研究证明冬凌草对食管癌、乳腺癌、肝癌、贲门癌及结直肠癌等癌症均有着较好的治疗缓解作用,其中Ponicidin(PON)作为冬凌草的主要活性成分之一,具有明显的抗肿瘤作用。然而PON是否具有抗肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)及转移的作用,目前还没有文献明确地进行过相关报道。因此,本课题组通过文献检索挖掘及预实验提出相关假说,PON可能具有抗肿瘤细胞EMT及转移的作用,且相关机制可能与AKT/GSK-3β/Snail及AKT/GSK-3 β/β-catenin信号通路相关。本课题组从体外细胞相关研究出发,探究了 PON对于TNF-α诱导的结直肠癌细胞EMT及转移的作用。首先通过药物对细胞EMT的影响实验,从细胞表型的变化初步判断PON具有抑制HCT116细胞EMT的作用,接下来通过细胞划痕实验、Transwell迁移与侵袭实验明确了PON具有抗结直肠癌HCT116细胞转移的作用。之后又分别通过实时荧光定量PCR、免疫荧光、Western Blot实验探究了PON抗HCT116细胞EMT及转移可能相关的分子机制,证明了PON对影响HCT116细胞EMT的相关生物标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin有显著性影响,同时对AKT/GSK-3 β/Snail及AKT/GSK-3 β/β-catenin通路具有一定程度的抑制作用。在体外细胞研究的基础上,课题组又通过体内整体动物实验,建立起了HCT116细胞的裸鼠结直肠癌肝转移模型,进一步研究了PON在动物体内对HCT116细胞EMT及转移的影响。结果发现,PON对于该模型裸鼠的结直肠癌细胞的EMT及转移具有较好的缓解抑制作用,可以有效地减少脾脏肿瘤的体积及肝脏转移瘤的数量,并且能够缓解裸鼠体重减轻的状况。接下来,课题组通过HE染色实验对裸鼠肝脏组织进行了病理学评价,又通过IHC实验对肝脏转移瘤进行了检测,探究了PON抗结直肠癌细胞EMT及转移可能的体内相关分子机制。结果表明,PON可以缓解裸鼠肝脏的肿瘤细胞浸润程度,其抗结直肠癌细胞EMT及转移的机制可能与促进E-cadherin的表达、抑制N-cadherin、p-AKT、p--GSK3β、β-catenin以及转录因子Snail的表达有关。课题组进一步采用杆状病毒表达载体系统,在草地贪夜蛾虫卵细胞Sf9中对上游信号蛋白AKT的亚型AKT1和AKT2进行了蛋白表达,获得了相应的蛋白质产物。利用生物膜干涉技术对AKT1和AKT2蛋白与PON的相互作用进行了初探。结果发现,PON与AKT1及AKT2蛋白可能存在一定程度的亲和作用。课题组最后运用虚拟分子对接技术,利用Schrodinger Suites软件对PON与AKT1及AKT2进行了分子对接。结果显示,PON可能在AKT1及AKT2的ATP活性口袋处存在相应的结合位点,最终与相应的氨基酸残基形成了非共价键作用力,从而与AKT1及AKT2蛋白产生了亲和作用。综上所述,课题组通过体内外实验证明了PON具有抑制结直肠癌HCT116细胞EMT及转移的作用,其相关的分子机制可能与影响EMT相关生物标志物以及抑制AKT信号通路的激活相关。此外,课题组还通过建立杆状病毒表达载体系统对AKT蛋白的亚型AKT1和AKT2进行了蛋白表达,通过生物膜干涉技术初步探究了AKT1和AKT2蛋白与PON可能的亲和作用,并进一步通过分子对接技术预测了PON与AKT1及AKT2蛋白可能的结合模式和结合位点。这些研究揭示了中药活性分子PON可能具有成为抗肿瘤转移药物的潜力。