[目的]CTCs是恶性肿瘤发生血道转移的关键因子,不同CTCs之间存在异质性,不同表型的CTCs携带着不同生物学信息,因此对其分子表型进行鉴定能帮我们更好的认识肿瘤的本质特征。β-catenin在多种恶性肿瘤中活化,是Wnt信号通路的重要组分,在肿瘤发生发展中起到重要作用。索拉非尼是目前用于临床治疗肝癌的的唯一靶向药物,然而并不是所有的患者都有较好的获益,耐药现象较为普遍,因此个体化治疗显得尤为重要。已有相关研究通过肝癌CTCs建立指导索拉非尼个体化治疗的方法,且有研究发现索拉非尼能抑制肝癌中Wnt信号通路。因此,我们尝试对肝癌CTCs进行β-catenin分子表型鉴定,试图探索其对指导索拉非尼用于肝癌个体化治疗的潜能。[方法]1.采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测肝癌细胞系QGY-7701、SMMC-7721、 HepG2、Hep3B、Huh-7、LM3、正常肝细胞系WRL-68、肝星状细胞系LX2、淋巴瘤细胞系SU-DHL-4中β-catenin的表达情况,了解不同细胞系中β-catenin表达差异情况。2.构建四色免疫荧光染色技术并用于检测肝癌CTCs及其β-catenin表型差异的方法学。(1)采用Ficoll-Paque PLUS分离液进行密度梯度离心联合MACS去除分选策略获取血液样本中的PBMCs,并掺入肝癌细胞系QGY-7701到血液样本建立肝癌CTCs血液模型。(2)对建立的肝癌CTCs血液模型进行四色免疫荧光染色鉴定,检测目的蛋白β-catenin的表达情况。(3)采用上述建立的四色免疫荧光染色方法检测35例肝癌患者血液样本中CTCs及其β-catenin的表达情况。作为阴性对照,纳入10例健康志愿者血液样本进行检测。(4)采用免疫组织化学方法检测对应的35例肝癌患者肝组织石蜡切片中β-catenin的表达情况,比较肝癌CTCs与肝癌组织中β-catenin的表达情况,并做相关性分析。3.扩大检测样本,对纳入检测的93例肝癌患者计数CTCs并检测其β-catenin表达情况。其中12例患者接受了索拉非尼治疗,比较治疗前后CTCs数目变化及β-catenin表达变化情况。收集并统计相关临床病理资料及随访生存信息,初步评估肝癌CTCs计数及其β-catenin分子分型在指导索拉非尼个体化治疗中的应用潜能。[结果]1.淋巴瘤细胞系SU-DHL-4几乎不表达β-catenin,正常细胞系WRL-68、肝星状细胞系LX2、所有肝癌细胞系QGY-7701、SMMC-7721、HepG2、Hep3B、 Huh-7、LM3均有表达β-catenin,其中β-catenin在肝癌细胞系QGY-7701中表达量最多。2.建立的CK/CD45/DAPI/β-catenin四色免疫荧光染色方法可准确鉴定掺入肝癌细胞系的血液CTCs模型中不同肝癌细胞,可准确检测出不同肝癌细胞之间β-catenin的表达差异。3.建立的CK/CD45/DAPI/β-catenin四色免疫荧光染色方法可在鉴定肝癌CTCs的同时检测其β-catenin表型,可准确检测出不同CTCs之间β-catenin的表达差异。在受检的35例肝癌患者中,有31例检出了CTCs,检出率占88.6%。每5 mL外周血样本中检测到的CTC数目最少2个,最多51个,平均19±11个。10例健康志愿者未检测到CTCs。检出CTCs的31例患者中,β-catenin阳性表达的患者有25例,阴性表达的有6例,阳性率占80.6%。不同患者CTCs中β-catenin表达情况有差异,β-catenin阳性表达率从0%到100%呈现出不同的表达水平,同一患者不同CTCs之间β-catenin表型也存在差异。总计CTCs个数为575个,有384个CTCs有β-catenin表达,总阳性率达66.8%。4.对应的35例肝癌组织中,有5例未检测到β-catenin表达,检出率占85.7%。在30例检出β-catenin阳性表达的肝癌组织中,可见β-catenin广泛定位表达于胞膜与胞质,有19例发生β-catenin核聚集。5.对比研究31例HCC患者CTCs与肝癌组织,28例患者CTCs与对应的肝癌组织中β-catenin表型一致,总体检出一致率达90.3%,统计分析显示两种样本检测结果基本一致且具有相关性,因此,我们认为CTCs样本可以代替组织样本进行β-catenin表型检测。6.扩大检测样本,总计93例肝癌患者有10例未检出CTCs,83例检出CTCs,阳性检出率高达89.2%。CTCs计数最少2个,最多61个,平均24.4±14.9个。β-catenin+个体65例,占78.3%；β-catenin-个体18例,占21.7%。83例HCC患者检出CTCs总计2026个,β-catenin阳性表达的CTCs总计1312个,β-catenin,总阳性率为64.8%。并在1例患者血液样本中检测到CTM。7.对83例检出CTCs的HCC患者临床资料进行统计,分析CTCs的β-catenin表型与临床特征之间的关系。结果显示β-catenin表型与PVTT存在相关性,即β-catenin＋个体更容易形成PVTT。8.8.12例晚期肝癌患者接受索拉非尼治疗2周后再次采集患者外周血进行CTCs计数及β-catenin表型鉴定。与接受治疗前进行对比,治疗后大部分患者CTCs数目均有不同程度的下降,仅有1例患者CTCs数目增多。治疗前后CTCs总数变化无明显差异(43±14个 vs 32±15个,P=0.077)。β-catenin阳性CTCs数目治疗前后变化也无明显差异(28±14个 vs 25±15个,P=0.610)。P-catenin阴性CTCs数目治疗后显著下降,差异有统计学意义(15±9个 vs 7±6个,P=0.020)。和表型为β-catenin阳性CTCs数目相比,表型为β-catenin阴性的CTCs数目总体下降幅度较为明显(52.3% vs 10.8%,P=0.000)。[结论]本研究建立的CK/CD45/DAPI/β-catenin四色免疫荧光染色方法简便实用,可用于肝癌CTCs的β-catenin表型鉴定；肝癌CTCs可以代替肝癌组织进行β-catenin分子表型检测；不同肝癌个体的CTCs之间以及同一肝癌个体的不同CTCs之间β-catenin表型存在异质性；β-catenin阳性CTCs能促进肝癌患者形成PVTT;索拉非尼对β-catenin阴性的CTCs杀伤作用更显著；肝癌CTCs的β-catenin表型检测可用于临床指导索拉非尼个体化治疗,在治疗过程中进行实时动态监测和评价疗效；对β-catenin-患者与β-catenin阳性CTCs比例较低的β-catenin+患者可推荐积极应用索拉非尼治疗。