微孢子虫是一类专营细胞内寄生生活的单细胞真核生物。微孢子虫有1300余种、近160个属,对人类健康、养蚕业、养蜂业、水产养殖业等造成严重威胁。家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原,对世界各地养蚕区造成严重的经济损失,目前还没有特别有效的疫苗或药物能够防控家蚕微孢子虫的感染。病原体的表面蛋白是最先、最直接接触宿主细胞的物质,能介导寄生虫——宿主的相互作用。家蚕微孢子虫的表面蛋白暴露于孢子最外层,在信号识别、孢子粘附宿主细胞等过程中发挥着关键的作用。因此,系统的鉴定家蚕微孢子虫表面蛋白的组成对于研究家蚕微孢子虫的侵染机制非常重要,也可为控制家蚕微孢子虫病提供有效的诊断标志和药物靶标。然而,由于技术障碍,专门针对家蚕微孢子虫表面蛋白质组鉴定的研究资料很少。本研究通过生物素-链亲和素系统、蛋白质组学方法对家蚕微孢子虫表面蛋白进行了分离和鉴定。主要研究结果如下:1.家蚕微孢子虫表面蛋白的生物素标记效果家蚕微孢子虫孢子经生物素Sulfo-NHS-SS-biotin孵育后,采用间接免疫荧光定位(IFA)检测其标记效果,结果显示在孢子表面有强烈的绿色荧光信号。与此相反,在未经处理的孢子表面以及孢子内部细胞器等没有检测到阳性荧光信号。这些结果表明,家蚕微孢子虫孢子表面蛋白被生物素成功标记。2.家蚕微孢子虫总蛋白提取条件的优化提取到丰富的总蛋白是分离纯化获得尽可能丰富表面蛋白的前提。然而,家蚕微孢子虫孢壁的几丁质特殊结构,给孢子总蛋白的提取增加了难度。为了解决这一问题,我们采用了高温高压法、煮沸法、研磨法、超声波破碎法,并结合尿素、SDT、Leammli、Na OH裂解缓冲液探索提取家蚕微孢子虫总蛋白的最佳条件。SDS-PAGE检测结果显示:0.1M的Na OH裂解液整合超声波破碎法提到的总蛋白最为丰富,为本研究采用的最优方法。3.家蚕微孢子虫表面蛋白的分离和质谱鉴定分离纯化被生物素标记的家蚕微孢子虫表面蛋白,LC-MS/MS质谱鉴定和生物信息学分析,最终鉴定获得23个假定表面蛋白。其中,有5个已报道的定位于家蚕微孢子虫表面的蛋白,分别是SWP5、SWP8、SWP12、SWP26、SWP30;另有6个假定表面蛋白预测有信号肽,1个假定表面蛋白(登录号EOB13402.1)有跨膜域;有8个假定表面蛋白被信息学预测为假定细胞外蛋白质,有7个假定表面蛋白没有功能注释。这23个假定表面蛋白的GO分类结果显示,其中11个蛋白质能参与生物学过程,9个推测涉及生物粘附性和对刺激的反应以及生长或代谢过程,有8个具有ATP、GTP和核苷酸结合能力以及催化或翻译调节功能。4.家蚕微孢子虫假定表面蛋白SWP5、SWP8、SWP12、SWP26、SWP30、EOB14207.1的亚细胞定位实验验证为了进一步验证质谱鉴定的蛋白是否为表面蛋白,本研究选取了质谱结果中的5个表面蛋白——Nb SWP5、Nb SWP8、Nb SWP12、Nb SWP26和Nb SWP30分别进行Western blot检测。结果显示,这5个蛋白的特异性单一杂交信号出现在表面蛋白质谱文库中,说明质谱鉴定结果可信,也初步表明Nb SWP5、Nb SWP8、Nb SWP12、Nb SWP26和Nb SWP30为家蚕微孢子虫的表面蛋白。进一步利用家蚕微孢子虫孢壁蛋白Nb SWP5、Nb SWP8、Nb SWP12、Nb SWP26、Nb SWP30和EOB14207.1的多克隆抗体,分别对这6个蛋白进行了间接免疫荧光亚细胞定位分析。在多克隆抗体Anti-SWP5、Anti-SWP8、Anti-SWP12、Anti-SWP26、Anti-SWP30和Anti-EOB14207.1处理下,家蚕微孢子虫孢子表面呈现明显的绿色荧光阳性杂交信号,而对照组无任何荧光信号出现。各处理组孢子在核酸荧光染料DAPI的处理下,其细胞核为明显的双核,呈蓝色荧光。表明Anti-SWP5、Anti-SWP8、Anti-SWP12、Anti-SWP26、Anti-SWP30和Anti-EOB14207.1的抗血清能分别识别家蚕微孢子虫孢子表面的蛋白Nb SWP5、Nb SWP8、Nb SWP12、Nb SWP26、Nb SWP30和Nb EOB14207.1,并特异性地发生免疫反应。这在一定程度上说明,家蚕微孢子虫假定表面蛋白Nb SWP5、Nb SWP8、Nb SWP12、Nb SWP26、Nb SWP30和Nb EOB14207.1定位于家蚕微孢子虫的外壁表面。总之,本研究提供了一种专门分离家蚕微孢子表面蛋白的有效方法,所鉴定的表面蛋白有可能成为微孢子虫检测和抗微孢子虫药物设计的新靶标。